钙成像技术是如何工作的呢?|钙指标和实验方面的考虑

钙(Ca2 +)是一种重要的离子,扮演一个角色在各种不同的细胞功能。作为一个小的离子可以自由移动,迅速在细胞质和细胞的隔间。Ca2 +可以用作快速的指标从肌肉细胞(细胞)细胞活性神经元和许多其他人。工作在这一领域的开创性工作可以追溯到1970年代,钱永健和合作者Ca2 + EGTA的螯合性能。钙的这些年来,发展指标(Ca2 +指标)仍在继续提供洞察细胞生物学基础,例如细胞如何响应在不同疾病状态,或针对治疗药物。在本文中,我们将看看不同的荧光指标开发监测钙信号,当地的钙含量和通量的研究或细胞内空间动力学和隔间。

单波长测量钙

最快最方便和Ca2 +指标使用单一波长染料。这些通常用来表示活动,他们往往更友好共焦成像,因为他们经常与常见的激发和发射波长和光源。

Fluo-4

单一波长Ca2 +指标,Fluo-4是使用最广泛的。Fluo-4有机染料的吸收峰值在490 nm和发射在520纳米左右,从而使它几乎适合488兴奋和525年发射-请参阅下面的图。

图2:吸收和发射的Fluo-4 Ca2 +指标染料。

Fluo-4相对明亮和稳定从而能够在较短的曝光和得到一个强烈的信号以最小的光毒性,因为它也不需要紫外波长可能产生更多的活性氧。Fluo-4低亲和力Ca2 +指标这意味着它允许高钙离子浓度测量饱和之前,但不适合测量低Ca2 +的浓度,如静息细胞。在单波长测量通常比较荧光发射活动期间使用比率,静息状态的F (t) / F (0)。定性测量Ca2 +的浓度可以通过这种方式实现,但这给定量测量的局限性,需要规范化的数据占变化,和整个实验。潜在问题包括细胞的染色不均匀加载,光漂白和泄漏的染料在细胞研究。

Rhod染料

另一组单一波长Ca^{2 +}指标是Rhod染料。虽然不被广泛使用,它们的注意转移的激发和发射波长越长。X-rhod-1例如,580海里的激发和发射在600海里。这一原则的波长转向红色有助于减少光毒性,自发荧光和影响组织内的光散射,所以Ca的数量^{2 +}红色区域的指标继续扩大。在长波长工作的另一个好处是允许多路复用与其他荧光蛋白标记,或可能促进optogenetic控制使用通道视紫红质膜电位(锁et al ., 2015)。

比率计染料对细胞内钙- Fura-2 Indo-1

比率计染料可用于定量工作因为他们正确的众多变化成像条件和样品的准备工作,如染料浓度的变化或光漂白效果。这允许校正和标准化之间的数据不同的实验。比率计Ca2 +指标表现出发射或吸收光谱的变化作为当地Ca2 +浓度的函数。acetoxymethy (AM) esterized形式的这些染料的首选裂解这些分散在细胞膜和细胞内酯酶的细胞加载过程更加容易和有效的。

Fura-2

所有的比率^{2 +}指标,Fura-2是最著名的。Fura-2展品微分吸收在340 nm和380 nm)的函数^{2 +}(见下图)。这个变异的检测显示通过排放在510纳米左右的相对强度。

图3:激发Fura-2 Ca2 +指标染料在不同自由Ca2 +的浓度。改编自分子探针荧光探针和研究化学物质的手册

的成像协议Fura-2因此单一波长要复杂得多^{2 +}指标和需要提供照明的光源340和380海里。Fura-2成像需要连续照明与340 nm和380 nm)检测在510 nm,紧随其后的是一双pixel-wise比率的计算发射图像。图像可以进一步分析校准对自由离子的浓度。Fura-2具有高度的亲和力^{2 +}使它适合精确的定量测量在Ca^{2 +}在低水平但不是很高的浓度(通常1μM以上)。然而,有许多Fura-2染料亲和力较低的开发为测量允许更高的Ca^{2 +}浓度。

Indo-1

另一个著名的比率计染料是Indo-1,但在这种情况下染料改变其发射效率在405 nm和485 nm左右两座山峰。Indo-1很兴奋在340纳米左右,可以连续成像与过滤器集中在405 nm和485 nm排放峰值。

图4:激发Indo-1 Ca2 +指标染料在不同浓度的自由^{2 +}。改编自分子探针荧光探针和研究化学物质的手册

与Fura-2一样,图片是pixel-wise比率,可以校准反对自由- Ca^{2 +}浓度。Indo-1的一个潜在的问题是,它可以在一些实验条件下相对photo-instable。通常用于流式细胞仪测量中,这不是一个问题。

基因编码钙指标(GECI)

另一类Ca^{2 +}指标的基因编码钙指标(GECI)。GECI Ca^{2 +}指标如GCaMP (Nakai et al . 2001年)来源于绿色荧光蛋白(GFP)变体。GECIs允许进行体内钙的研究,目前广泛应用于转基因动物模型。通过使用GECIs可以研究复杂的神经网络在单细胞水平以及研究更广泛的空间关系在组织内的特定细胞类型,否则不可能使用电生理测量。

变色GECI依赖于烦恼信号监测当地的Ca^{2 +}通过改变浓度排放在绑定Ca供体和受体之间的平衡^{2 +}。变色融合两个直接与钙调蛋白荧光蛋白和M13肽产生这样的传感器。在绑定Ca^{2 +}、构象变化和增加烦恼这些蛋白质之间的耦合,将发射波长比率。

GCaMP-X提供了一个家庭的这些GECIs钙-监控应用程序bob综合app官网登录https://www.janelia.org/open-science/gcamp。持续发展的一系列GCaMP衍生品现在已经使他们更适合研究包括彩色GECIs打开多路复用Ca^{2 +}成像实验,允许更好的理解一些复杂问题面临的神经科学。

表1:常见的Ca的例子^{2 +}指标显示,注意各种衍生品是可用的,包括高和低亲和力形式以适应不同的实验。K_d值的缓冲区——价值最终将取决于温度、离子强度、pH值等因素随每个实验。

Ca^{2 +}绑定特异性,亲和力和绑定

Ca的特异性^{2 +}指标是考虑其他二价阳离子如钙镁、锌可能干扰测量。紧密和Ca的速度有多快^{2 +}指标结合Ca^{2 +}离子钙成像研究也是很重要的方面。绑定关联的定义是钙的浓度^{2 +}一半的Ca^{2 +}指标分子与Ca绑定^{2 +}在平衡时,表示为一个摩尔值(nano毫摩尔),低价值表明高亲和力。应该选择指标衡量Ca^{2 +}浓度在0.1和10倍K_d裴瑞兹(et al .,2008)。这个范围内选择,以避免重大变更的束缚和自由^{2 +}在细胞中。一般来说,高亲和力Ca^{2 +}指标可以用来研究Ca的较低水平^{2 +}胞质中发现,低亲和力Ca^{2 +}指标可以用来研究Ca的浓度更高^{2 +}通常发现在亚细胞的隔间。Ca的速度有多快^{2 +}指标结合,解放也可以对一些重要研究动力学。这是所描述的缔合常数K_一个。K_一个本身是由两部分组成:描述该协会速率常数k_在除以分解速率常数k_从。还请注意,K_一个1 / K_d。

实验注意事项

工作所需的短的波长比染料具有挑战性的光。在本节中,我们来看一些关键的注意事项:

推荐光源钙成像

图5:酷pe - 340^fura已由pe - 300系列专为Ca吗^{2 +}成像(图片由克里斯•Deeks酷)。

而常见的光源是广泛适用于单一波长的研究中,比率计研究通常不是这种情况。水星灯具展览相当多峰的强度剖面不适合比率成像。相比氙气灯有一个相对平坦的可见光谱强度,但强度下降对紫外线,最受欢迎的比率计染料是兴奋。此外,电弧灯容易生活,在几百个小时的顺序和包含危险物质的处理,但由于led的发展在过去的10 - 15年,电弧灯现在有效地过时了。我们可以利用led的Ca^{2 +}成像提供高强度照明和固态可靠性,永久和切换速度。

特别是,很酷的pe - 340^fura能满足照明的需求比率计和单波长染料在单个单元:

• 专用的340 nm和380 nm led Fura-2和Indo-1比率计钙成像
• 广泛的白色输出(435 nm - 645 nm) Fluo-4或者GECIs GCaMP6
• 微秒切换个人渠道通过TTL捕捉高速事件
• 稳定的LED照明将噪音降到最低
• 从单个TTL-out测序激发
• 兼容大多数成像软件集成控制与成像
• 典型的寿命可以达到20000小时

适合钙成像的探测器

做出最准确测定细胞生理学的最低光照强度和应该使用尽可能低的染料浓度的指标。这本质上导致低光子排放意义一个敏感的探测器是非常重要的。有两个主要相机技术用于Ca^{2 +}——sCMOS和EMCCD成像实验。的选择,比如Ca^{2 +}指标取决于这项研究本身的广泛应用。bob综合app官网登录

一般来说,尤其是sCMOS摄像头和或Zyla sCMOS相机一直是最广泛用于Ca吗^{2 +}成像实验。这些相机非常适合大多数实验:

• 最佳的信号噪声比,高灵敏度高达82%和1 e -噪音
• 高时间分辨率- 100 Hz全帧,> 1 KHz在较小的领域的观点
• 宽领域的观点——21.8毫米(5.5 Zyla)
• 高分辨率- 6.5µm像素西装流行60和40 x
• 全球快门选项——当整个视野时间准确性是至关重要的

的Zyla sCMOS相机因此保持Ca的建议^{2 +}成像。阅读更多关于神经生物学成像探测器解决方案。

最近,新一代的背景sCMOS相机出现了,现在给替代之前的基准Zyla sCMOS相机Ca^{2 +}成像。新Sona背景系列基于Zyla模型的性能保持重要的高速,高分辨率和类主要定量准确性(的关键比率成像)和添加:

• 高灵敏度- 95%量化宽松政策提高灵敏度和响应在更广阔的范围延伸,用于多路成像和染料对紫外和红外区域
• 更高的视野- 32毫米(4.2 Sona b-11)
• 高动态范围达到53000:1
• 永久的真空技术最高寿命
• 深冷却至-45°C制服传感器响应少添入的过滤

尽管sCMOS及其持续发展的广泛适用性,EMCCD探测器技术继续保持高度相关。通过利用电子倍增,iXon EMCCD相机s是单光子敏感,因此在光子水平低于检出限的当前sCMOS相机。光饿死了Ca的一些示例^{2 +}适合敏感性越高的成像实验iXon EMCCD相机:

• 快Ca^{2 +}成像光子通量较低,可能需要额外的敏感性EMCCD由于信号水平低在非常短的曝光
• GECIs研究——日益增长的数量和范围研究使用这些表达了Ca^{2 +}指标通常涉及非常弱的排放水平——iXon EMCCD经常发现是首选检测器的选择

找到更多关于EMCCD摄像头Ca^{2 +}成像看到心脏检测器解决方案^{2 +}研究

相关的出版物

• 钱Grynkiewicz G, Poenie M, RY (1985)。“新一代的Ca^{2 +}大大提高了荧光性能指标”。生物。化学260 (6):3440 - 50。PMID 3838314
• 锁JT,帕克,史密斯。比较荧光Ca²⁺指标成像当地Ca²⁺培养细胞的信号。细胞钙。2015;58 (6):638 - 648。doi: 10.1016 / j.ceca.2015.10.003
• Wahl M, Lucherini MJ, Gruenstein大肠细胞内Ca^{2 +}测量与Indo-1 substrate-attached细胞:优点和特殊考虑。细胞钙。1990年8月,11 (7):487 - 500。0143 - 4160 . doi: 10.1016 / (90) 90081 - 5。PMID: 2272082。
• Nakai J, K Ohkura M,并且绕着圆圈圈打转(2001年2月)。“高信噪比Ca (^{2 +})探测器由一个绿色荧光蛋白”。自然生物技术。19 (2):137 - 41。doi: 10.1038/84397。PMID 11175727。S2CID 30254550。
• 帕雷德斯RM, Etzler JC,瓦LT,郑魏W, Lechleiter JD (2008)。化学钙指标。方法。46:3页143 - 151。ISSN 1046 - 2023。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2008.09.025。