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显微镜学校第五课-荧光光学显微镜的原理

利用透射光学显微镜,研究人员可以对标本的形态有一个概述。然而,细胞内的特定结构和蛋白质的定位是不可能的。荧光显微镜填补了这一空白,引入了化学染料的使用,允许细胞内结构的定位。

这些染料可以与抗体偶联以识别特异性蛋白质,或者对特异性细胞结构具有亲和力,例如DNA,线粒体等。荧光蛋白的发现进一步推动荧光显微镜技术和应用的发展。bob综合app官网登录荧光蛋白向Live-Cell荧光显微镜张开门,衍生物,如FRAP,FRET,PHEAVICATIVE / OPTOVERICS等。荧光蛋白也常用于需要更复杂硬件的其他技术,例如TIRF。

为了能够理解荧光显微镜技术的全部潜力和可能的应用,有什么是荧光和荧光显微镜的背景知识是至关重要的。bob综合app官网登录在本次网络研讨会上,Florindo博士将介绍荧光的概念,以及这种物理特性如何应用于显微镜。我们将简要概述荧光显微镜所需的硬件,并讨论启动荧光成像协议时应考虑的一些问题。

总的来说,我们的目标是让参加本次网络研讨会的个人获得(刷新)关于荧光显微镜电位的知识。我们希望为研究人员提供更好的工具来规划他们的工作。

学习目标:

  • 了解荧光的原理。
  • 解释给定荧光团的光谱。
  • 获得荧光显微镜所需硬件的概述。

问题回答:

  • 如何选择荧光色素以避免光谱重叠?
  • 应该选择哪个滤光片来成像给定的荧光团?
  • 光漂白是什么?

我是克劳迪娅·弗洛林多,安多尔生命科学公司的产品专家。在今天的网络研讨会上,我将解释荧光是如何工作的,做荧光显微镜实验和获取图像需要什么硬件,荧光显微镜的注意事项是什么,然后如何建立和设计你自己的实验。让我们从头开始。荧光是什么?

荧光是由原子或分子发出的光子,这些原子或分子的电子被瞬时激发到一个更高的能态,并从基能级到更高的能级。一旦它们回到基态,它们就会发射一个光子,这就是荧光。这是一个原子的表示法原子核和电子在周围运动。一旦有外部辐射进来,电子就会进入更高的能态,然后它们会下降到更低的能态,它们会发射光子。当电子回到地面时所释放的能量总是比激发电子的能量要低。由于这个原因,这个光子会有一个波长,一个比入射光波长长相应的波长。

因此,当入射光停止存在时,荧光发射将自动停止存在。能发出荧光的分子称为荧光色素。事实上,在显微镜中,我们已经在荧光显微镜中使用了荧光色素它们的吸收和发射光谱已经被很好地描述了。所以,对于一个特定的荧光色素,我们知道它会吸收特定波长的光。所以,我们知道我们应该用哪种光来激发它,我们也知道特定荧光染料的发射波长所以我们知道我们应该用哪种滤光片来捕捉来自荧光染料的光。这些是某一特定荧光色素的最大吸收和发射峰。

stokes位移是某一特定荧光色素的吸收峰和发射峰之间的纳米差。对于荧光染料,有几个特性会影响荧光染料的亮度,如化学环境、pH值、氧化还原电位、离子强度等。在荧光染料中有几个特征是非常重要的。其中之一就是量子效率,即吸收的光子与发射的光子之比。这意味着量子效率越高,这种荧光色素就越好,这种荧光色素能够将吸收的光转化为发射的光,所以它就会越亮。

耐淬火。因此,猝灭是一个降低样品荧光强度的过程。一些分子间的相互作用可以导致猝灭,如分子重排、能量转移和基态络合物的形成。所以,如果荧光色素变得淬灭,他会大大降低发射的荧光和抗光漂白的能力。光漂白是指某一特定的荧光色素在荧光照射下造成的不可逆的损伤。所以,当它被漂白后,它会发出荧光,不再发出荧光。

以下是生命科学中常用的荧光色素的概述。我们有化学染料,如Alexa, Hylite,和菁染料。例如DAPI,吖啶橙,俄勒冈绿。还有生物染料,其中大部分来自绿色荧光蛋白,尽管目前有其他生物产生这些荧光蛋白,并进化为我们提供了彩虹色的调色板。再谈谈荧光蛋白,正如我刚才提到的,有一个荧光蛋白的调色板可供研究人员使用,他们可以用这些荧光蛋白做多种颜色实验。

它们中的大多数来自于原始的GFP,即绿色荧光蛋白,但其中一些实际上来自于在其他生物体中发现的新蛋白质。但是荧光蛋白不仅仅是,已经有很多了,在彩虹的所有颜色中发光。有光转换荧光蛋白。这些蛋白质开始以特定波长辐射光。但一旦被激发,就会变成另一种波长的发光。在一个特定的实验中,这使得我们可以在一个特定的时间点追踪一个超级细胞群。

其他的例子是光激活荧光蛋白,它在被照射和激活的那一刻之前不会发出任何光。甚至是光开关荧光蛋白,其中的蛋白质开始有一个发射波长,比如绿色。一旦被辐射,改变它的发射波长变成红色,再进一步辐射,它又会变成绿色。这些是一些荧光蛋白的例子,可以用于多种应用,如CRISPR技术,光基因工具,等等。bob综合app官网登录

现在,继续到EP荧光显微镜的硬件。我们从光源开始。有一个光源,它将发出适合荧光显微镜的几个波长的光。但是,我们将需要一个过滤器多维数据集来选择适当的波长。过滤器组如何运作?它将具有激励屏障,二向色镜和发射滤光器,激励屏障或激发滤波器。然后我们拥有目标,两个混合和探测器可以是大多数时间的是相机。在这里,我们有一个Andor相机的示例。所以我们有光源。光源将发光多个波长,但我们只想用蓝光激发。

我们有一个激励滤波器,它将只选择合适的波长到达样品。它进入物镜,也就是样品,然后用另一种波长反射回来,一种更长的波长,能量更少的光。反射蓝光的二色体现在允许绿光通过,而发射滤光片作为进一步的屏障,进一步选择我们想要获得的波长。至于可以用于荧光显微镜的光源,我们有汞弧光灯、氙弧光灯、金属卤化物灯或led,这些灯目前由于其低能量辐射而被广泛使用。它们对荧光显微镜非常有用。或者,如果您使用多模式系统,如蜻蜓,您可以使用集成激光引擎,ILE,激光广域照明。

看一下滤镜立方体的内部。滤光片立方体的主要组成部分是,如前所述,激励滤光片,从光源中选择所需波长的第一个势垒,二向色镜,它就像一面镜子,将想要的波长反射到样品,然后允许发射光通过激励滤波器和探测器。然后激励滤波器作为进一步的屏障来选择我们想要的特定激励的精确波长。再详细解释一下,从图形和波长的角度,什么是滤光片,它是如何工作的?

正如我之前提到的,过滤器设置将再次强调,将允许特定波长的样品激励,也将允许检测特定波长的样品发射后的激励。在图形方面,我们有激励滤波器,它选择通过一个特定的波长。这是二向色镜,它反射这条线以下的波长。我们想象这是400纳米,低于400纳米,但是允许波长比这些长。这里是发射过滤器,它将作为进一步的屏障来选择发射波长。

总之,激励滤波器具体允许激发波长光的通过。二向色镜会将激发波长光引导到样品,并专门允许发射波长光的通过,发射滤光器将进一步串行通道,即将到达检测器的光的段落。因此,根据其区分不同波长的容量,不同类型的过滤器根据其区分不同类型的滤波器命名。激励滤波器通常是短通滤波器,因为它们允许通过更短的波长的通过。发射滤波器通常是长通滤波器,允许更长波长和阻挡较短波长的通道。二向色滤器或分离器反映了一些波长,同时允许通过其他波长。

也有窄带通滤波器,可以阻挡较短或较长的波长,只允许一个窄带的波长通过。利用不同的滤光片和二色镜的特性,我们可以创建一组特定的滤光片,足以进行多色荧光成像实验。可以使用两种基本类型的滤镜,单色和多色滤镜。单一的荧光滤波集将使更高的信噪比,但较慢的成像,而多色滤波集将使更快的成像,但较低的信噪比。

现在我们来谈谈显微镜的一个非常重要的部分,那就是物镜。必须记住,显微镜下的一切东西都是物质。例如,如果你计划使用DAPI你有一个紫外线过滤器,一个可以在显微镜下看到DAPI和紫外线染料的过滤器,你用DAPI给你的样本染色然后你去到显微镜下你看不到。也许你的染色没起作用。好吧?但也可能是另一件事。如果你的目标无法传输紫外线染料,紫外线波长?如果是这种情况,您将永远不会看到DAPI实现这个目标。因此,您需要了解您正在使用的硬件,并根据具体的硬件调整您的实验设置。

因此,物镜的类型有消色差物镜、萤石物镜和消色差物镜等,但它们会因所提供的校正类型和所提供的成像类型而不同。更高的NA对应更高的分辨率。NA是数值孔径,指的是物镜捕捉更大角度光线的能力。我已经讨论过紫外光的透明度,但是其他对客观性能很重要的特性你们应该知道当你们在考虑物镜时它们是否由低荧光玻璃制成。

此外,如果他们能够提供所需的传送光技术,那么这些目标的校正就具有萤石和ApochroMat的校正是一种计划,即它们被校正的平面,以及如果它们被纠正彩色平面换档。荧光显微镜的目标也充当冷凝器。

现在我要谈谈相机。我将简要介绍一下相机。如果你想对显微镜的相机和探测器有更广泛的了解,请参阅本课程之前的讨论。问题是,摄像头怎么样?荧光显微镜下的相机是彩色的还是黑白的?好吧,答案就在这里。在荧光显微镜中,最常见的是黑白相机。然后我们有了这些美丽的,多色的图像。如果相机是黑白的,我们怎么能有这些美丽的,多色的图像?我们有这三幅彩色图像。 But in fact, what we do when we are acquiring is we acquire a micro tool grayscale image, a simple grayscale image, and the DNA grayscale image.

然后,我将,相机,软件将把所有这些灰度图像映射到65000种灰度,如果它是一个16位相机,变成65000种绿色,红色和蓝色,颜色就会出现。这就是我们的多色图像。我们为什么要这么做?我们为什么不马上用彩色相机拍摄呢?对于彩色相机,想象这是一个16像素彩色相机的芯片。通常情况下,为了在彩色摄像机中与我们的眼睛匹配,所有像素都被一个滤镜遮罩,滤镜可以是绿色、红色或蓝色。为了更好地匹配我们的眼睛,如果这是一个16像素的相机,从这16像素中,有一半,如8,是绿色的,1/4是红色的,1/4是蓝色的。这将在……如果被辐射到探测16个像素分辨率的光,我们只能……能分别检测出8种绿色和4种红色、蓝色。 Therefore, we would have less resolution on a color camera than if all the pixels would be detected for each color individually. On the other hand, if I have a black and white camera, and I have the light source, it goes to the sample, it goes into the detector, all my pixels will be used to capture the green light, the blue light, and the red light. And therefore, I will have more resolution in a single image.

荧光显微镜的注意事项。荧光显微镜的注意事项包括自荧光,可用的荧光滤光片集的穿透效应,即发出并被绿色荧光滤光片集捕获的荧光铬也可能被紧挨着的红色滤光片集捕获。这是一个绿色和红色的例子。但我的意思是,从荧光染料发出的光,应该被滤光片a捕捉到,不仅被滤光片a捕捉到,而且被相邻的滤光片b捕捉到。染料光漂白是荧光染料的不可逆损害和生命细胞光毒性。“生命细胞光毒性”顾名思义,就是指细胞在活体成像实验中由于高能辐射而死亡,而高能辐射对细胞是有毒的。

自体荧光的原因包括内源性分子的自体荧光,对给定实验不理想的滤光片的使用,以及对所用固定剂的反应性。人们需要记住,最好记住不同的固定物会产生不同的自体荧光。所以,首先,我们需要选择最佳的固定程序,其次,适当地固定我们需要看到的蛋白质,如果可能的话也要减少自体荧光。光在光路中的散射也会引起自体荧光。

再来谈谈渗血效应。当成像多个荧光色素或荧光蛋白时,渗滤效应是非常相关的,因为来自一个特定结构或蛋白质的信号将在相邻的滤光器中捕获,并将掩盖来自两个蛋白质或结构的信号。渗滤的原因包括一个非理想的滤光片组,其中的带通波长与所用的荧光染料非常接近,但没有优化,以及相关的,实验或显微镜设置的非理想荧光染料选择。

可能的解决办法是,减少曝光时间。如果你减少暴露时间,你将会减少出血的影响。使用带通较窄的高特定滤波器。但可能会有一些信号交叉,所以请执行您的实验控制,以确保您没有漏透,或您知道漏透的数量,即您将从一个通道漏透到另一个通道。讨论染料光漂白。所以,染料光漂白,正如我之前提到的,是氟铬的可逆损伤,这里你有一个样品的染料光漂白的例子在经过10次激光扫描后几乎停止照射任何光,因此它几乎对探测器来说是不可见的。因此,请注意并避免光漂白。

再讲一点染料光漂白。所以,染料光漂白在延时显微镜中也是非常重要的。这是一个电影的第一个时间段的例子,最后一个时间段你几乎看不到被组蛋白GFP染色的细胞核。再讲一点染料光漂白。它是由荧光色素在光线下暴露增加引起的。这种暴露将导致自由基的形成,自由基将导致荧光色素分子的修饰,从而使荧光变少。它将导致从单态态到三重态的转变。极其重要的是,光漂白是不可逆的。所以,一旦我们漂白荧光团,它就不会再发光了。所以避免光漂白。 To avoid photobleaching, please use the most photostable dye possible.

减少样本中的氧气。你怎么能做到呢?你可以使用氮气和氧气清除剂。在包埋介质中使用抗褪色试剂。毫不奇怪的是,减少你用来获取图像的曝光时间。然而,作为任何事情,如果利用我们的优势,可以是一件好事。所以光漂白也不是一无是处。有一种非常著名的技术,它允许多种应用和研究分子扩散的动力学,囊泡的运输,沿着微管的运输,它被称为FRAP。FRAP为光漂白后荧光恢复。这是一种技术,它可以让我们看到细胞在受到如此多的光线照射后,在细胞特定区域恢复荧光的速度有多快,以至于所有的荧光色素都被漂白了。

这允许从一个区域确定分子的扩散系数到电池的另一个区域。这里是使用使用Andor Mosaic的Frap的示例,其中漂白这些特定区域。你可以看到他们变黑了。然后,您可以将分子的扩散从细胞的其他地方视为黑色区域。继续前进,请在荧光显微镜中的警告中,我现在将谈论活细胞光毒性。透过紫外线光线的光源会对我们试图造成图像的细胞造成损坏,这并不奇怪,因为我们都知道我们在没有太阳拦截器的情况下走出太阳,我们会晒上晒伤。细胞也可以获得一种,而不是晒伤,但高充电的光线灼伤,我们需要在执行实时成像时避免这种情况。

那么,问题是什么呢?其中一些问题是所用的滤光片和二色镜不能完全有效地阻挡类紫外线波长。这种无法阻挡这些波长的能力会对细胞壁和细胞膜造成损害并导致细胞快速死亡。解决这一问题的方法包括使用紫外线过滤器降低紫外线辐射的影响,缩短曝光时间,平衡氧化还原环境。使用激光宽场消除,它将有选择地照亮样品,只有所需的,选择的波长线。重要的是,要使用能量较低的较长的波长。如果可能,使用近红外波长。它可以避免紫外线。它在光谱的另一端。

近红外波长是较长的波长和较少的能量。所以,这对细胞更好,更健康,而且它也提供了允许更深入地渗透到样本的优势。而且大多数引起自体荧光的分子在近红外波长上不发荧光。这实际上是开始使用这个波长的一个很好的赌注。最近,已经有一些荧光蛋白和荧光色素化学染料可以使用近红外波长。而且,重要的是,如果你要选择,选择一个与实时成像实验兼容的系统。其中一个系统可以是,例如,双微透镜旋转磁盘系统。

现在,我们来谈谈设置和设计。当你设置和设计一个实验时,你需要考虑我的研究所有什么显微镜?那些显微镜有什么滤镜?还有,不要……不要忘记,就像我之前提到的,目标是什么?有哪些激光线可用?非常重要的是,我想做什么?那么,我想做什么呢?我想想象一个活的样本还是一个固定的样本?我是想进行多色实验还是单色实验?

在做这个实验的时候,我要怎么染色呢?我会使用荧光抗体,荧光蛋白,或者量子点。我要用什么?我需要选择合适的荧光色素或荧光蛋白,它们能被我将要使用的设备看到。我需要设计样品制备方案。在使用显微镜之前,设计成像采集协议是非常重要的,但有时却被忽视了。我要如何获取我的图像?

总之,在这次谈话中,我已经通过了荧光工作如何,EP荧光显微镜,荧光显微镜的警告以及需要考虑建立和设计荧光实验的事情是如何进行的。所以现在,我只需要感谢大家听这个谈话。我实际上邀请您跟进我们的andor显微镜学校系列。接下来,你有共聚焦显微镜的课程,以及免疫组化样品制备。非常感谢聆听,我希望您可以加入本课程的其他课程。

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