蜻蜓:扩展显微镜的理想共焦系统

扩大样本成像的挑战

光学显微镜的分辨率受到光的衍射极限的限制，这意味着，除非研究人员使用，否则无法区分距离小于200纳米的结构超分辨率技术。2015年，麻省理工学院的Edward Boyden实验室开发了一种超分辨率方法(Chen et al.， 2015)。非但没有提高显微镜的光学分辨率，扩张显微镜“扩展”样本的各向同性。这种技术得到了广泛的关注，不仅因为它是一种超分辨率的替代方法，还因为它可以与现有的超分辨率技术结合，进一步提高显微镜的极限“看”．查阅。的协议的完整摘要扩张显微镜，请阅读我们的技术文章-什么是膨胀显微镜?．

然而，要想成功地进行图像扩展样本，还需要克服一些挑战。其中一个主要的挑战是由方案的不同步骤引起的荧光损失。细胞器固定程序的复杂性导致抗体标记的问题，导致样品信号低。在膨胀过程中，聚合物的单体被输送到细胞内，一旦进入细胞内，就会触发聚合(凝胶化)。在凝胶化过程中，交联效率低，导致水凝胶中信号保存碎片化。下一步，均匀化步骤旨在避免样品失真，并确保样品组织保持完整。然而，在均匀化过程中荧光信号可降低高达60%。实际膨胀时，4倍膨胀意味着64倍体积膨胀;因此荧光信号的荧光团密度和亮度降低了64x。因此，成像扩展样品需要一个足够灵敏的仪器来检测弱光信号。 Other challenges consist of dealing with the expansion itself including imaging a very large field of view (Figure 1.), and imaging deep into the sample. These requirements are problematic and difficult to achieve with conventional microscopes.

图1所示。HeLa细胞未膨胀微管(右)和4.5倍线性膨胀微管(左)共聚焦图像。成像是在一个Andor高速旋转圆盘共聚焦显微镜(蜻蜓）采用40× 1.15数值孔径的水浸物镜。(一)HeLa细胞与免疫染色微管的共聚焦图像，在细胞底部的单个xy平面上成像。左上方的插图放大了右边中间的小盒子。(B)一个~ 4.5×线性扩大的HeLa细胞的免疫染色微管共聚焦图像，在细胞底部的单个xy平面上成像。左上方的插图放大了左下方的小盒子。(B)中的比例尺表示膨胀后比例尺。只有一小部分扩展后的细胞能填满整个视野。各自的插入显示了整个视野中各自小框的缩放。(Zhang, C.， et al .，当前的神经科学协议, 2020)。

扩展样本成像技术解决方案

为了克服扩展样本的信号损失，需要一个高灵敏度的采集系统。研究人员需要使用一种显微镜，可以促进最佳的光传递到样品，并非常有效地捕获样品中的所有光子，即。高量化宽松探测器．高灵敏度相机的使用使基于相机的共焦系统成为从扩展样本中捕获所有信号的理想解决方案，甚至是最黑暗的的人。

此外，对于高生产率的图像扩展样本，大视场的采集是必须的。因此，多点共聚焦显微镜可以在瞬间提供大视场采集的图像，这是一个完美的解决方案。多点共聚焦需要优化针孔间距，以避免针孔串扰，允许成像深入厚的扩展样品。此外，厚的膨胀试样大，并且在许多情况下，多个tile需要能够收集样本上的所有三维信息，就像在图2和视频1．理想情况下，该系统应该有一个非常平坦均匀的照明，当与软件结合使用时，可以实现无缝拼接。

视频1。小鼠海马扩大样本捕获和或蜻蜓呈现在伊万里瓷器．在视频中，研究人员利用了蜻蜓的大视场和北极星高度均匀的照明。这一结果提供了一个完美缝合的老鼠海马体电影，其中脑细胞的细节可以清楚地可视化。感谢加州大学圣地亚哥分校医学院显微镜核心设施的Jennifer Santini

使用多个波长是一个重要的要求，它将允许用户标记样品中的众多目标，并获得不同结构的定位信息以及它们如何相互关联。近红外(NIR)波长的使用是一个额外的好处，不仅扩展了荧光色卡，而且非常重要的是，近红外波长深入到样品中。

此外，使用超分辨率技术对扩展的样品进行成像将提高分辨率。例如，将扩展显微镜与SRRF(超分辨率径向波动)相结合，将使单是扩展样品获得的分辨率至少增加2倍。

Figure 2．线粒体输入受体的最大投影图像。用HSP70(细胞器胞质侧膜-紫色)、TOM20(线粒体外膜-橙色)、DAPI(细胞核-青色)进行扩增后标记，与和或蜻蜓．安特卫普大学Line Verckist提供。

图像扩展样本的Andor解决方案

和或建议蜻蜓共焦配备了iXon Ultra 888背光EMCCD,或者是Zyla 4.2 2p sCMOS摄像头显微镜的扩张。双透镜旋转盘系统，结合高灵敏度emccd和sCMOS探测器，即使在染色较弱的样品中也能提供高质量的图像。蜻蜓优化的针孔间距，使成像深入到样品没有针孔串扰。此外，Andor的专利Borealis照明提供了整个视野的均匀照明，这是在一个大的扩展样本上成像多个瓷砖的关键因素。结合大视场，22毫米对角线，蜻蜓可以提供梦幻般的图像与卓越的生产力。

在下表中，我们介绍了蜻蜓旋转盘共聚焦如何解决当前和未来成像扩展样本的挑战

引用:

1. Chen, F.， P.W. Tillberg，和E.S. Boyden，扩展显微镜。科学,2015。
2. 张春华，康建生，高锐，张春华，张春华，张春华，张春华，康建生，张春华，高锐，张春华，张春华，张春华，康建生，张春华，张春华，张春华，康建生，张春华，张春华，张春华，康建生，张春华，张春华。目前的协议Neuroscienc,