离子信号传导显微镜

细胞内离子研究的技术广泛用于生物学中，例如，以鉴定活细胞内钙水平的空间变化，测量细胞内离子的浓度，包括细胞pH，并监测这些浓度如何随时间变化。监测细胞内离子变化对于我们对细胞系统中的信令和功能途径的理解至关重要，以肌肉收缩以及突触神经信号传输等许多基本过程。这种测量是一系列研究计划的核心，包括药物发现研究。钙通道代表一种重要种类的细胞膜分子，称为离子通道。因为这些开放或关闭，例如响应细胞外信使分子，细胞内离子浓度也可以改变，改变细胞的表现。直接在这些离子通道上起作用的治疗剂可以为许多疾病提供有效的治疗方法。例如，靶向钙通道的药物可用于治疗各种心血管障碍。荧光染料设计成具有对特定离子的亲和力;例如，Fura-2特异于钙离子。当它们与离子结合时，改变它们的吸收或荧光特性。 The principle of ion concentration determination is such that, when the free ion concentration changes, the equilibrium between free indicator dye and ion-bound dye also changes, resulting in a change in the photophysics of the indicator dye.Ratiometric microscopy is one approach for such measurements - by quantitatively interpreting the changes in fluorescent properties by looking at both bound and unbound dye ratio, the concentration of the ion being investigated can be measured. However, there are some common non-ratiometric dyes also, such as Fluo-4.

选择的荧光图像，用Revolution 488，从1500帧动态系列30帧/秒，显示Ca2+波的进展，因为它的进展通过兔子尿道肌肉细胞。从细胞内偏移roi得到的动力学图显示Ca2+通量的时间进展。使用相同的视场且没有分界点，帧率被推至120fps，以获得更好的事件时间分辨率。由丹多克理工学院平滑肌研究中心的马克·好莱坞博士提供。

在许多组织类型中，离子通量变化迅速，通常在低毫秒的时间域内发生。因此，离子结合荧光染料往往具有快速的响应，使自由离子浓度的变化能够以高时间分辨率成像，这就需要一种快速定量成像这些荧光强度变化的手段。然而，最终，我们实际上受到这些染料的结合常数的限制——不论离子浓度变化有多快，成像的速度不需要不超过染料扩散、结合和对自由离子作出反应所花费的时间。一种是更好地确定染料的结合常数，并使用合适的曝光时间。使用太短的曝光时间会不利地影响信号到镜头的噪声比，这是最终限制检测现象(会使你的图像看起来颗粒状和未解决的)，即使在“完美”光子探测器(100%量子效率(QE) +零噪声下限)存在的情况下也是如此。另一个必须考虑的因素是使用的离子染料的浓度。在理想的情况下,尽可能低的染料浓度作为指标的自由离子的浓度,这样微不足道的染料结合大量的离子和离子物种的总量问题,因此它不显著改变束缚和自由的统计平衡离子。补救方法是尽可能降低浓度，同时仍然保持曝光时间所需的适当的信噪比(因此帧率)。

离子信号显微镜的Andor解决方案

Andor的EMCCD技术，无论是作为我们革命共聚焦的关键组成部分，还是作为“独立”EMCCD + IQ成像软件解决方案，是离子浓度超敏感的快速成像的证明解决方案。以快速帧速率可实现的信号到噪声（S / N）非常适合于细胞内可视化和测量常见的离子结合染料，例如钙特异性氟-4。EMCCD技术使读数噪声能够完全否定，即使在非常快速的读出速率下，也适用于钙瞬态过程的时间要求，例如钙火花或波。具有512 x 512的像素格式的IXON Ultra 897能够使用128 x 128的ROI具有595帧/秒，具有“裁剪模式”特征。此外，IXON3 860背光能够> 500帧/秒@ 128 x 128像素格式。通过使用EMCCD，还降低了钙染料浓度，使钙波沿着细长的平滑肌细胞的全长繁殖。高灵敏度也使得能够减弱激励力。通过最小化激励力，无论是基于激光还是灯，都可以显着降低染料的光漂白率。在活性细胞环境中，这些“较温和”的激发条件也降低了否则将杀死活细胞的光毒性效果，使它们能够在更长的时间段内进行研究。

近年来，随着sCMOS技术的引入，研究人员发现大视场、快速度和低噪声有利于离子成像实验。安铎有多种sCMOS探测器可供选择，以适应广泛的离子信令应用。bob综合app官网登录Andor的Neo和Zyla 5.5有一个550万像素的传感器和“真正的全球快门”模式，如果你想在一张图像中同时拍摄多个信号事件，这是必需的。另外，Zyla 4.2拥有一个420万像素的传感器，具有更高的QE，为测量离子浓度提供更高的灵敏度。所有来自Andor的sCMOS相机同时提供大视场(5.5 MP或4.2 MP)、极低噪音(< 1e -)、宽动态范围(33000:1)和非常快的帧率(100 fps持续)。