光谱流式细胞术扩展到可见光和近红外荧光光谱技术

流式细胞仪的固有设计在单个颗粒的多参数测量中具有独特的优势，其中每个荧光颗粒与一个独特的检测器相匹配。然而，收集光谱标记粒子的完整发射光谱的长期目标仍然是难以实现的。近年来，圣地亚哥拉霍亚生物工程研究所的约翰·诺兰教授和他的团队通过将高通量色散光谱仪与标准设计的流式细胞仪相结合，朝着这一目标取得了重大进展。

介绍

Nolan组开发了一种光谱流动细胞仪（SFC），其能够通过将分散光谱仪代替传统流式细胞仪上的传统反射镜，滤波器和光电倍增管（PMTS）来获取单颗粒的完全发射光谱。SFC的关键组件是高速，多元素CCD检测器，其在通过仪器探针体积通过仪器探针容积期间能够在单个细胞的短路期间收集完整的高分辨率频谱。通过这些探测器的高灵敏度计，尤其是在近红外光谱区域的高灵敏度，以及通过片上衬砌能力来增强传统流式细胞计，允许信号增强，同时最小化噪声，从而提高了测量。高灵敏度检测器具有高通量成像光谱仪的耦合允许测量时间接近每秒200个事件。

设置

诺兰集团的第一代SFC具有一个收集和检测系统，能够使用表面增强拉曼光谱(SERS)来区分粒子。由于[1]拉曼光谱在相对小的光谱窗口内具有较窄的光谱特征，因此非常适合于多参数测量。拉曼流式细胞仪已被证明能够在单个纳米颗粒水平上表征大块纳米颗粒制剂的拉曼活性群体。[2]这使得SERS标记纳米粒子合成的优化成为可能，从而产生大量具有高拉曼活性的纳米粒子。最近，该系统已被用于区分用两种不同的SERS标记抗体标记的细胞群。拉曼光谱流式细胞仪非常适合处理流式细胞术中的许多常见应用，然而荧光标记是最常用的标记剂。bob综合app官网登录因此，需要一种能够区分可见光和近红外发射探测器相对较宽发射的系统。

为此，Nolan团队开发了两种第二代sfc(图1)。[4]第一种配置为可见荧光检测，基于商用流式细胞仪(FACSCanto, BD Biosciences)的光学工作台。由488 nm或405 nm激光激发，通过流式细胞仪光束控制和整形光学直接对流式细胞。该光谱检测系统由光纤耦合全息光谱仪和457 nm边缘滤波器或488 nm陷波滤波器和宽带体积相位全息光栅耦合到牛顿DU970-UVB EMCCD探测器组成。第二种系统类似于前面描述的[1]的拉曼流式细胞仪，但配置为近红外荧光，并使用785 nm二极管激光器进行激发。发射的光通过光纤耦合到HoloSpec成像光谱仪，该光谱仪带有785 nm边缘滤波器和窄带体积相位全息光栅，使用牛顿DU920NBRDD进行检测。在这两种系统中，光谱检测采用各自光学平台的前角光散射(FALS)检测系统进行触发。

与传统的流式细胞仪相比，采用色散光学、高通量光谱仪和高灵敏度CCD探测器提供了更强的多路复用能力。但是，为了实现增加的数据到多参数细胞和粒子的应用，光谱分解数据分析程序是必需的。bob综合app官网登录Nolan小组将两种光谱分离方法应用于荧光光谱流式细胞术数据。第一个复制了传统的流式细胞仪与光学滤光片光谱分离。在采集后分析中应用数字滤波器，以分离总信号的不同谱分量。与传统方法相比，这种方法有很大的优势，因为滤波器的数量只受光谱数据点的数量限制，而且每个滤波器都可以被调整，以精确匹配荧光染料的发射光谱。即使如此，这种光谱滤光片分析的能力是有限的，因为荧光染料典型的宽光谱特征确保了具有相似发射光谱的染料在相邻滤光片之间有大量的串音。第二种方法使用自定义的非负经典最小二乘(CLS)程序。这种方法假定从荧光染料混合物中检测到的信号是各组分光谱的线性组合。使用这种方法，光谱分离可以清楚地识别荧光标签，即使是在光谱高度重叠的情况下。

结果与讨论

图2:用以下Qdots (QD525, QD565, QD585, QD605, QD655，和QD705)染色的单珠的平均光谱。将平均荧光强度归一化为每个量子点的平均峰值强度。

为了描述SFC用荧光标签区分粒子的能力，Nolan团队使用优化了可见检测的仪器测量了用六个不同量子点中的一个标记的微球(图2)。波谱流式细胞仪不仅能唯一识别每个微球上的标签，还能确定每个成分的存在量。此外，光谱混合程序可以解释六种不同标签的绝对亮度的差异，从而为定量荧光标记抗体测量提供基础。接下来，研究小组测量了两种、三种、四种、五种和所有六种量子点标记微球的混合物，并成功地识别出每种成分以及所有五种混合物的相对丰度。最后，将该技术应用于常见的流式细胞术应用，分析淋巴细胞亚群中使用的典型表面标记物染色的PBMCs。CLS分离的光谱流式细胞仪能够区分CD14+单核细胞和CD3+ T细胞以及CD4和CD8阳性亚群，证明了该仪器在“现实世界”的应用能力。bob综合app官网登录

图3：用以下近红外荧光团染色的单珠的平均光谱：Alexa 750，IRDYE800，Dylight 800，Cy7.5，平均荧光强度已被标准化为每个单独Qdot的平均峰值强度。

传统的流式细胞仪在红色和近红外光谱区域中争取光谱检测，主要是由于PMT（量子效率= 2-8％）在该区域中的性能相当差。在分散光谱仪上使用背部发光的深耗尽（BRDD）检测器将使SFC利用该光谱窗口中发射发射的荧光染料的增加。为了探测近红外荧光应用在光谱流式细胞术中，Nolan组在NIR中表征了七种不同的荧光标记的微球。bob综合app官网登录在测试的七个染料中，三个（Alexa 750，Cy7.5和Dylight 830）具有足够区别的光谱，以允许用Cls解密的独特测定，（图3）。结果表示近红外光谱区域的光谱流量细胞仪的有希望的未来，染料已经在商业上可用。具有远红近红外发射的明亮染料的发展的增加应在不久的将来在流式细胞术应用中使用该光谱区域的使用。bob综合app官网登录

参考文献

1. Watson, d.a.， Brown, L.O.， Gaskill, D.F.， Naivar, M.， Graves, S.W.， dorn, S.K.， and Nolan, J.P.，“用于测量拉曼光谱的流式细胞仪”，Cytometry Part A, 73A, p119-128， (2008)
2. Sebba, d.s.， Watson, d.a.， Nolan, J.P, High Throughput Single Nanoparticle Spectroscopy, ACS Nano, Vol. 3 No. 6 p, 1477-1484， (2009)
3. Nolan, J.P., Duggan, E., Liu, E., Condello, D., Dave, I., Stoner, S.A., Single Cell Analysis Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) Tags, Methods Vol 57, p272-279, (2012)
4. 诺兰，J.P.， Condello, D.， Duggan, E.， Naivar, M.， Novo, D.，可见和近红外荧光光谱流式细胞术。Cytometry Part A. Vol. 83, No. 3, p253-264 (2013)