SPIM -选择性平面照明显微镜概述

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发育生物学中的模型系统使用各种转基因动物，其中荧光蛋白标记单个细胞、特定组织或整个胚胎。这种荧光转基因生物提供了在高分辨率的发育过程中可视化细胞和组织行为的机会，并且，实时观测，可能阐明塑造复杂生物体所涉及的动力学。这常常受到成像设备技术限制的限制。体内成像可以潜在地以单细胞分辨率捕获定量数据。当这种成像是在完整的、功能完整的生物体上进行的非侵入性成像时，时间推移显微镜允许随时间的发展进行研究。

荧光显微镜技术在分辨率、速度和穿透力方面已经变得越来越强大，它们通常只在薄而透明的样品中这样做。整个胚胎的大小和透明度通常只有几毫米，这使得实现单细胞分辨率特别具有挑战性。此外，由于样品的大小、完整和不透明组织的分散、未处理动物的色素沉着、活器官(骨骼肌、肠道、心脏、血液、眼睛等)的运动以及需要将样品保持在生理可持续的条件下，在活标本中可以达到的分辨率通常低于固定标本。由于这些限制，科学家们被迫固定和切片他们的样本，即使在发育过程中发生的许多高度动态的过程只能在完整的活胚胎中进行详细研究。

SPIM是一种荧光显微镜技术，使用聚焦光片从侧面照亮标本。SPIM在高穿透深度下获得了优异的分辨率，同时具有微创性。与现有技术相比，SPIM具有许多优点，如强烈减少光漂白，高动态范围和高采集速度。这些特性使SPIM成为研究开发的流行技术。

SPIM和其他基于光片的显微镜技术背后的思想是从侧面照亮样品，在检测光学焦平面周围有一个明确的体积。尽管这个想法有许多不同的实现，但基本原理是相同的。

在SPIM中，圆柱形光学被用来创建不同厚度的薄片。光向样品会聚，又向样品发散。光片的腰部位于视场的中心。轻片的尺寸可以适应不同的样品尺寸:对于较小的样品(20-100 um)，轻片可以做得很薄(~ 1um);而对于较大的样品(1-5毫米)，薄片必须更厚(~5-10毫米)，以保持相对均匀的视野。SPIM的重要之处在于，只有样品的聚焦部分暴露在激光下，这提供了光学切片，并大大减少了光损伤。此外，从聚焦部分发射的荧光信号在整个视场平行检测，这提供了高成像速度。

光穿透深度在光片显微镜中基本上受到光散射的限制。为了克服这一障碍，同时多视点光学薄片显微镜被开发出来。该技术消除了由缓慢的连续多视图成像引起的时空伪影，并引入了强大的新功能。同时多视图SPIM可以在生物相关的时间尺度上，使用来自Andor的sCMOS技术，从多个方向快速成像大型荧光标本。该技术克服了连续多视图策略的局限性，并能够在大型活体标本中实现快速动态事件的定量系统级成像。

图1:具有两个照明和检测方向的选择平面照明显微镜示意图，由Lars Hufnagel提供，EMBL，海德堡。

SPIM的Andor解决方案

来自Andor的全系列sCMOS相机是SPIM的理想探测器。Neo 5.5和Zyla 5.5配备了550万像素的传感器，在不影响读取噪声或帧率的情况下，提供了大视场和高分辨率。Zyla 4.2有一个420万像素的传感器，在600 nm的QE为72%。来自Andor的sCMOS相机具有6.5微米的小像素尺寸，这确保了pointspread函数的足够过采样，即使是对于低放大倍率的目标(例如10x NA 0.3;20x NA 0.5)。即使与性能最高的慢速读出ccd相比，读取噪声也非常低。Neo 5.5和Zyla 5.5可以实现1 e-的读噪声，而Zyla 4.2的读噪声为0.9 e-，都没有信号放大，而Neo 5.5和Zyla 5.5分别以每秒30和100帧的速度读取550万像素，Zyla 4.2为100帧，从而促进了开发过程中发生的动态事件的实时采集。