旋转盘共聚焦显微镜概述

在传统的广角光学显微镜下，标本沐浴在激发荧光团的光中(图1一个)．样品在物镜焦平面外发出的荧光干扰了焦内特征的分辨。随着样品厚度的增加，在失焦信号上捕捉精细细节的能力变得越来越具有挑战性。共焦原理通过使用针孔拒绝失焦光，增加了提高横向和轴向分辨率的好处。正是这些好处使共焦显微镜如此受欢迎，为什么你会在大多数核心成像设备中发现它。

可以看出图2(图中)，只有来自右平面的光(用绿色表示)通过针孔。从成像平面上方的平面(用红色表示)发出的光集中在针孔上方，因此大多数光无法通过针孔。相反，来自成像平面以下的平面(用黄色表示)的光集中在针孔之前，不能通过针孔。因此，只有来自一个平面的光才能聚焦通过针孔，或如其名称所示的“共聚焦”。类似的原理也适用于针孔相机，它利用针孔在没有镜头的情况下获得清晰的图像。

共焦显微镜

共聚焦显微镜现在是广泛应用于生物科学的常规光学技术，从植物科学到哺乳动物模型。它的使用很受欢迎，因为它比传统的广角显微镜有几个优点，即它能够去除失焦信号，从较低的聚焦深度捕获信息，在厚样品中成像离散的光学部分，因此创建高对比度的3D图像集。

最常见的共焦技术是共聚焦激光扫描显微术(样品形貌)．在这种格式中，样品被来自激光(图1 b)．激光束在光栅模式中逐点扫描，然后由光电倍增管从每个点依次检测信号，直到生成完整的图像。使用CLSM，在图像分辨率和速度之间需要权衡。如果该阵列由512x512像素阵列组成，并且每个点的照明时间为1微秒，那么每次扫描大约需要262毫秒。每个点的信号必须在这1个µs内采集，扫描的第一个点和最后一个点之间存在0.26秒的时间“偏差”。为了补偿每个像素的短暂光照，需要一束强烈的激光束，如果标本是动态的，时间偏差会导致观测误差。

图1所示。说明常规宽视场、激光扫描和旋转圆盘显微镜的照明模式的示意图。在广角显微镜(a)中，样品被激发光广泛照射，其能量有限的焦点由物镜的数值孔径和焦距所决定。激光扫描共聚焦显微镜(b)通过一个小孔径(针孔)聚焦一个单点的激光，然后逐点扫描整个样品。旋转盘共聚焦显微镜(c)用1000个针孔的旋转模式照亮样品，以实现完全同步的共聚焦照明。

旋转盘共聚焦激光显微术(SDCLM)通过利用多路复用原理．图1 c说明了样品如何在多个点同时被照亮，以及如何检测到光。这最初是由Felgett在光谱学中证明的，并表明使用并行检测可以提高灵敏度。王的一份出版物提供了用于成像活细胞标本的点和盘扫描系统的定量比较。

图2。横河CSU-X的双圆盘排列。除了包含针孔阵列的基本磁盘外，还有具有微透镜匹配图案的第二收集器磁盘。微透镜以更高的效率将激发光聚焦到成像针孔上，从而将激发通量从有限的~2%提高到功能性的70%。这项技术的改进，结合使用电子倍增CCD探测器，导致旋转盘技术成为快速活细胞共聚焦成像的理想解决方案。

图2显示了如何双旋转盘共聚焦激光扫描仪运营。与传统的激光扫描显微镜不同，在SDCLM中，一个扩展的光束照亮了排列在(集电极)圆盘上的微透镜阵列。每个微透镜具有与第二(针孔)盘横向协同对齐的相关针孔，并轴向位于微透镜的焦平面上。这些磁盘被固定在一个由电机高速驱动的公共轴上。当圆盘旋转时，扫描仪与位于其主成像平面上的针孔圆盘相连接，聚焦激光束阵列就会扫描样品。横河意识到这种方法的好处，并创建了他们的CSU旋转盘共焦单元。Andor的蜻蜓多模态共焦技术将这一技术提升到了一个新的高度，它提高了通量、光照的均匀性和针孔间距，可以处理从单分子到酵母到3D模型器官(类器官)的更广泛的标本。

针孔(和微透镜)以一种模式排列，扫描由阵列孔径大小和显微镜物镜放大倍率定义的视场。扫描激光束激发样品中的荧光标签。在这个阵列聚焦的地方——焦平面，荧光发射最强烈。这些光的一部分将沿着激发路径返回，在那里它将被相同的“共聚焦”针孔优先选择。一个反射发射波长的二色镜位于两个圆盘之间。这将激光发射与从显微镜光学反射或散射的任何激发光分离开来。发射路径的几何形状产生了具有极低背景噪声的共聚焦荧光信号。

的使用是传统CSLM的进一步限制光电倍增管(pmt)其量子效率(QE，将光子转化为电子的概率)相当低——通常为30-40%。相比之下，SDCLM技术使用相机作为探测器，可以有非常高的量化宽松;例如,和或iXon + 897 EMCCD峰值定量宽松超过90%，使其成为近乎完美的探测器。这种双旋转盘和高QE探测器的组合提供了一个可高速运行的共焦仪器，具有无与伦比的信噪比(SNR)。

在我们的白皮书:为什么你的下一个共焦点应该是蜻蜓