TIRF显微镜

TIRFM利用了一种光学效应，可以适应于观察发生在两种不同折射率的光学介质之间的界面上的荧光事件。入射到这样一个边界上的激发光，以大于临界角的角度传播，经历全反射。总的内部反射光的电磁场延伸到样品的界面之外，只延伸几百纳米到第二介质的低折射率-本质上是在z方向。此外，这种消逝场的强度沿穿透的z轴呈指数衰减。只有位于倏逝场内的样品部分受到荧光激发。TIRFM被限制在玻璃/样品界面的几百纳米范围内，在那里发生了全内部反射。TIRFM是一种越来越流行的可视化技术，具有高的信号背景比，发生在活细胞的膜内和膜周围的过程(部分原因是可获得新的膜特异性荧光团)。与旋转圆盘共焦技术相比，旋转圆盘共焦技术可以快速生成近似的光学切片。当厚度为1μm时，TIRF消失场的激发体积仅扩展约1μm。进入样品100纳米，其强度在这段距离上呈指数衰减。 This gradient can later be translated into movements (in z axis) of fluorescently abeled organelles being trafficked from and to the plasma membrane. Since only a very thin sliver of excitation is being produced, we only detect photons that are created within that excitation volume, which has the effect of significantly improving signal to background. There are however, other sources of background photons in TIRFM that must be taken into account, and minimized where possible, as described below.

虽然100nm深度量级的薄激发体积听起来非常有用，但必须记住，由于TIRF效应的性质，我们不能让这个激发平面通过细胞。TIRFM是一种表面界面现象，因此仅限于研究载玻片玻璃界面附近100nm左右的样品。因此，在活细胞中，TIRFM非常适合捕捉高分辨率、高信噪比(S/N)的膜动力学系列事件，如胞吐和膜受体/转运体侧向动力学。TIRFM也是一种常见的单分子动力学成像技术，在生物学应用的单分子检测领域有更深入的介绍。bob综合app官网登录

目前已经发展了两种常见的TIRFM方法，通常称为目标型和棱镜型，每种方法如下所示。客观方法的主要优点是样品易于放置，便于操作，例如用膜片钳移液器。该方法要求通过显微镜引入激光，而红外光谱实际能够达到的角度需要使用一个数值孔径(NA) >1.4的油浸物镜。然而，物镜的结构会导致信号到背景的限制，包括来自浸油的自荧光和来自激励激光的杂散反射的组合，这些杂散反射再次完全内部反射回物镜。

棱镜型TIRFM图(左)和物镜型TIRFM图(右)

棱镜技术易于安装，尽管它的缺点是样品位于物镜和棱镜之间。因此，往往必须考虑更详细的样品放置和操作方法。激发区域与棱镜技术可能是广泛的,一般100μm束腰,照明领域是奉承,而信号与棱镜技术较低,所以背景光子噪声,大大既然棱镜没有流浪反射的激发光与客观TIRFM。人们也可以潜在地避免使用浸没油物镜及其相关的自体荧光。最终效果是，棱镜方法的信背景比可能更好，当使用安多的深冷iXon3 EMCCD相机技术时，要记住这一点非常重要，它提供的仪器噪声可以忽略不计。考虑到每种配置的相对优点和缺点，许多TIRF实验人员选择在他们的实验室中建立两种配置，使用更适合给定应用程序的任何一种。

动态成像多个不同的生物分子，以及它们在样品体积内的相互作用常常是人们感兴趣的。通过集成多线激光系统，TIRFM技术可以很容易地扩展到多个荧光团标签的成像，最好是具有声光可调谐滤波器(AOTF)调制的固态激光解决方案。这种技术可以很容易地应用于FRET分析，最好是通过在发射侧集成一个合适的束分裂装置。

活细胞显微镜设置，使人能够在TIRFM和广域表观荧光显微镜之间快速切换，后者为更深入地渗透到样品的激发，代表了一种灵活和强大的方法来研究细胞内运输机制。在耶鲁大学医学院德里克·图姆雷博士的电影实验室里，这种综合方法被用来观察囊泡通过细胞质并最终与细胞膜融合的过程。专门设计的利用声光调制器的光电系统已经在几个实验室组装，在TIRF和epi-荧光宽场之间同步振荡照明。

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