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利用共焦旋转圆盘显微镜了解听力障碍的分子基础
使用蜻蜓可视化毛细胞动力学
在英国,五分之一的成年人是聋人或有一定程度的听力损失。听力障碍会导致沟通困难,并可能导致社会孤立和抑郁的增加。COVID-19大流行对听力损失患者的影响格外严重,因为口罩和社交距离使沟通更加困难。除此之外,一些研究表明听力损失还有痴呆症,轻度听力损失可能会使患痴呆症的风险增加一倍,而严重听力损失的人患痴呆症的风险增加到五倍(了解更多).
听力损失有几个潜在的原因;这些因素包括年龄、噪音、基因、疾病和某些类型的治疗药物。导致耳部损伤的药物被称为“耳毒素”,其中一类药物就是氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类药物被用于治疗危及生命的细菌感染,如败血症和耐多药结核病,但作为一个不幸的副作用,它们破坏内耳的感觉毛细胞,导致听力丧失和平衡障碍。
内耳毛细胞之所以被称为内耳毛细胞,是因为它们的顶端有被称为静纤毛的纤细的毛发状突起,它会随着声音的震动而移动。毛细胞将静纤毛的机械运动转化为电信号,我们的大脑将其解释为声音(如讲话和音乐)。在人类和其他哺乳动物中,毛细胞不能再生,所以一旦失去,就再也无法替代。因此,听力损失是不可逆转的,因此,这一领域的研究非常重要。
在本文中,我们将介绍:
- Andor Dragonfly共焦系统的快速概述:
- 成像胞内运输;
- 偏光上皮的研究。
- 研究重点-理解感觉毛细胞的细胞内运输
图1 -转pou4f3 GFP基因的斑马鱼后侧线毛细胞。毛细胞在青色中表达绿色荧光蛋白(GFP),在品红中装载德克萨斯红庆大霉素(TRG)。在培养液中加入TRG,此时(添加TRG后3分钟)只有动纤毛和静纤毛被标记为TRG。使用Andor Dragonfly对细胞进行成像。A)毛细胞堆栈的最大强度投影(MIP) B)毛细胞堆栈的3D旋转。MIP和3D可视化的头发堆栈与Imaris软件组装。
偏振上皮成像Andor蜻蜓
偏光上皮细胞的研究需要多种实验方法,而光学显微镜在其中发挥了重要作用。
为了可视化这些细胞内的细胞内运输,成像系统必须允许温和的活体成像与高速图像采集协调。具有特殊背景排斥的高灵敏度系统是必不可少的。此外,系统应该提供成像在多种尺度,从亚细胞结构来组织,器官,或生物体水平(图1显示了成像的毛细胞住斑马鱼幼虫),允许研究者理解亚细胞动态如何影响组织器官或器官。
Andor的蜻蜓包括特殊的特征,是理想的极化上皮成像。它的高采集速度和实时3D渲染允许快速成像和可视化,而不损失任何分辨率。该系统可以实现每秒400帧的成像。对于器官或有机体内的这些细胞的概述,大视野结合北realis均匀照明提供无缝拼接,允许在每个规模上的实时可视化。
我们问Kenyon博士,为什么Andor的“蜻蜓”是理解感觉毛细胞细胞内运输的关键工具?
凯尼恩博士回答说:
"Andor Dragonfly在这项[毛细胞运输的研究]中发挥了不可估量的作用,特别是由于这些氨基糖苷在斑马鱼毛细胞中的运输发生在很短的时间内,需要快速获取图像."
“此外,用于识别细胞内隔间的染料特别容易光漂白,而蜻蜓号大大减少了这一点。”
图2 -器官型小鼠耳蜗外毛细胞培养。毛细胞用青绿色的LysoTracker和品红的德克萨斯红庆大霉素标记。使用Andor Dragonfly对细胞进行成像。使用Imaris软件对毛细胞进行三维旋转。
研究重点-理解感觉毛细胞的细胞内运输
艾玛·凯尼恩博士是由英国国家聋人研究所(RNID).凯尼恩博士在“kro/理查森实验室萨塞克斯大学生命科学学院神经科学系.这些实验室对了解内耳是如何工作和发育的很感兴趣。其主要目标是找出造成耳聋和平衡失调的主要原因。
凯尼恩博士的研究集中在拯救生命的耳毒性药物如何导致耳聋和平衡失调。更具体地说,她着重于氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素、卡那霉素)损伤感觉毛细胞的机制。凯尼恩博士研究的目的是保护毛细胞免受这些耳毒素的伤害,并保护需要这些药物的病人的听力。
术语表 | |
氨基糖苷类抗生素 | 氨基糖苷类抗生素是用于治疗革兰氏阴性菌的广谱抗生素,可与其他抗生素协同治疗革兰氏阳性菌。 |
庆大霉素 | 庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素。 |
卡那霉素 | 卡那霉素是氨基糖苷类抗生素。 |
器官型培养 | 体外培养从生物体中收集的器官的体外培养 |
Ototoxins | 耳毒素是引起耳朵损伤的分子(耳毒素=耳毒素)。 |
静纤毛 | 静纤毛是位于听觉和前庭系统感觉毛细胞顶端表面的毛发状突起,对听觉和平衡至关重要。 |
凯尼恩博士他的研究主要集中在感觉毛细胞的细胞内运输以及氨基糖苷在细胞内的运输。为了回答她的问题,博士凯尼恩已将一个荧光团(德克萨斯红)与选择的不同氨基糖苷结合。然后用荧光显微镜在斑马鱼侧线的感觉毛细胞和小鼠耳蜗培养中追踪。斑马鱼侧线含有与哺乳动物内耳(耳蜗)相似的毛细胞,但由于它们位于鱼的表面,无需额外的组织制备,就可以在活体动物中使用荧光显微镜对它们进行成像。斑马鱼侧线和小鼠耳蜗培养是本研究的互补模型,但它们也面临着挑战:
- 细胞内运输的可视化需要实时成像和高时空分辨率的快速图像采集。
- 成像需要在弱光下进行,以防止光毒性和光漂白。
- 准确显示抗生素的细胞内位置需要高的背景排斥反应和敏感性。
凯尼恩博士的实验涉及德州红共轭庆大霉素在毛细胞中的荧光共聚焦成像活斑马鱼幼虫或小鼠耳蜗培养物。毛细胞被以细胞内隔间为靶点的染料标记,并在设定的时间点拍摄图像。在斑马鱼模型中,头发细胞成像每五分钟到80分钟(图1),而用鼠标文化图像在2,4,16和24小时(图2和3)。这些实验允许跟踪庆大霉素和想象的运动细胞内的隔间时,他们可能被贩卖。
图4 -器官型小鼠耳蜗培养的外毛细胞的正交横截面。为了分析毛细胞,Kenyon博士利用了Imaris软件的直角视图,将德克萨斯州红庆大霉素和LysoTracker绿色庆大霉素的分布进行了比较,在所有平面上可视化。毛细胞用青绿色的LysoTracker和品红的Texas-Red庆大霉素标记。使用Andor Dragonfly对细胞进行成像。
我们已经问过博士。凯尼恩博士最后一个评论和或蜻蜓:
"我这个系统启动和关闭的速度非常快,非常适合进行实时实验."
该项目将资助到2021年底。
- 凯尼恩博士目的探讨感觉毛细胞的细胞内运输通路。具体来说,氨基糖苷的转运机制。
- 我们的期望是找出可以用来保护毛细胞免受耳毒性药物伤害的途径。最终目标是促进药物的发展对治疗感染有效,但不会增加听力损失和可能相关的痴呆症的风险。
参考文献
- 肯扬,2陈焕祯.et al。识别一系列毛细胞MET通道阻滞剂,以保护氨基糖苷诱导的耳毒性JCI洞察力。(2021) 6 (7): e145704
- O ' reilly M。et al .,卡维地洛衍生物的设计,合成和生物学评价,以保护感觉毛细胞免受氨基糖苷诱导的损伤,阻断机电传感器通道地中海,化学。2019, 62, 11, 5312-5329
- 肯扬,2陈焕祯.et al。鉴定离子通道调节剂,以保护氨基糖苷诱导的毛细胞死亡JCI洞察力。(2017);2 (24): e96773。
- 布朗M。, (2017)你的下一个共聚焦应该是蜻蜓的十二个理由.
- 肯扬Instagram帐户-实验室工作日的照片