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使用蜻蜓纺丝盘共焦于了解表观生物学的分子基础。
Silviya Dimova:在Meehan实验室中发现PRC2的表观遗传作用
表观遗传学是在基因组DNA中未加密的基因表达中的传染性修饰的研究,而是由于这个原因,被命名为(EPI)遗传 -(上图)遗传学.表皮能学与DNA或染色质蛋白的化学修饰相关联。常见的表观遗传修饰是DNA甲基化。DNA甲基化是一种对正常发育至关重要的压抑的表观遗传签名。
对转录的控制是正常细胞分化所必需的。Polycomb group (PcG)蛋白是发育过程中细胞分化所必需的,并作为转录抑制因子。有趣的是,DNA甲基化有一个意想不到的作用,确保Polycomb抑制复合物在整个基因组的染色质上的正确定位。
术语表 | |
染色质 | 一种在真核生物的细胞核中发现的DNA和蛋白质的复合物,其功能是将DNA分子包裹成更紧凑、更密集的高阶结构。 |
DNA甲基转移酶 | 甲基酶一种催化甲基向DNA转移的酶 |
表观遗传学 | 对DNA或染色质蛋白的化学修饰没有改变遗传码,但可以影响基因表达或编码蛋白质定位。 |
异染色质 | 通常为转录的浓缩染色质。 |
制 | 小鼠胚胎干细胞。 |
PCH | 在小鼠染色体的着丝粒处发现的中心周异染色质。 |
Polycomb | 一个蛋白质复合物家族这可以修改染色质并推广表观遗传学沉默的具体基因. |
PRC2 |
两个班级中的一个Polycomb-group蛋白质或(PCG)。这个综合体有组蛋白甲基转移酶活动和主要甲酸盐组蛋白H3在赖氨酸27(H3K27me3) |
的他的实验室(爱丁堡大学遗传与分子医学研究所)着重于了解小鼠胚胎发育过程中支持基因调控的表观遗传机制。一个关键的研究目标是更好地了解DNA甲基化和Polycomb复合物之间的关系:这两个系统如何协调以维持发育基因沉默?
Meehan实验室之前的工作揭示了全球DNA甲基化通过限制Polycomb沉积到其目标位点而对其起作用[1,2]。此外,研究小组还发现,重新编程小鼠胚胎干细胞的表观遗传状态,导致低甲基化状态,诱导Polycomb向邻近区域迁移。更具体地说,Polycomb成分异常地沉积在基因组的区域,在这些区域中,中心点周围异染色质(PCH)变得低甲基化。PCH结构域包含主要的卫星串联重复序列,在染色体动态和基因组稳定性中发挥着重要作用,特别是在有丝分裂期间。中心点异染色质结构域的主要特征是抑制信号:赖氨酸9在组蛋白H3 (H3K9me3)上的三甲基化。
Meehan实验室的主要目标是识别Polycomb成分的再分配在低甲基化小鼠胚胎干细胞(mesc)中是被动的还是主动的过程。
Silviya Dimova.(Meehan实验室的博士研究生/研究员)承认,她对Polycomb在他们的系统中被重定向到PCH的一致性感到着迷。此外,Dimova补充说,"我非常兴奋能够看到活细胞中的重新定位,因为到目前为止,大部分实验已经在固定细胞中进行。“
Dimova使用Tuncay Baubec在实时成像实验中开发的染色质读卡器构造[3]。这些构造非常有帮助,因为它们包含识别特定的组蛋白修改的域。在这种情况下,分析的表观遗传修饰是H3K27ME3(组蛋白H3,在赖氨酸27上改性 - 用三个添加的甲基))。H3K27ME3是PRC2(Polycomb压抑复合物2)沉积的修饰。
作为表观遗传学分析的前沿,Dimova和Meehan小组希望(实时)分析表观遗传修饰是如何诱导Polycomb重新定位的。表达Cbx7 (H3K27me3的染色质'reader')的质粒与GFP融合并成像Dragonfly Ultrafast Confocal.让西尔维娅能够在活细胞中进行表观遗传修饰.(图1)。
图1 -结果的初始验证。从图中可以看出,Cbx7-GFP(一种染色质'reader',在赖氨酸27上组蛋白3甲基化与GFP融合)的表达在对照和三KO细胞之间是相似的。由于表达式具有可比性,因此对初始方法进行验证。A,B- 将活细胞与活细胞进行成像和或蜻蜓.C, D-数据分析是通过创建表面Imaris 9.6..
如何在小鼠胚胎干细胞中进行表观遗传修饰?
实验室采取的方法是在没有任何功能性DNA甲基转移酶的细胞中引入上述构建体。该计划是在DNA甲基转移酶三重敲除(TKO)MESC中引入GFP-CBX7构建体,该细胞没有功能性DNA甲基转移酶(DNMT)。因此,报告者的修饰或迁移率将是由组蛋白改性而不是内源性甲基化引起的。重要的是,组蛋白修饰的重新定位也可以通过DNA甲基化调节。
最初的结果是令人兴奋的,因为GFP-Cbx7报告基因在DNA甲基转移酶KO细胞中以聚集信号的形式出现。因此,这表明Polycomb可能会从其常规站点重新定位到这些集群中。在这种情况下,研究结果将指出Polycomb的活跃重新定位是由DNA甲基化的损失驱动的。这一结果意味着,一些PRC1/2模式在mESC中动态重新分布,以响应改变的DNA甲基化状态,这可能也发生在小鼠早期发育中。Dimova补充道,“我们尚未确认报告者组成的簇是否对应于泌乳异素酸。”
为了分析数据并进行现场实验,Dimova必须克服几个挑战:
- 的显微镜探测器需要对报告的少量报告称为质粒来敏感。
- 其目标是能够在不干扰正常细胞功能的情况下将信号可视化。
- 显微镜需要有高效的照明结合极度敏感的探测器.
- 目标是激发荧光团并检测感兴趣的蛋白质而不会导致任何光毒性或光漂白。
- 图像胚胎干细胞,保持它们的视野(mESC在文化中经常移动)。
- 目标是以足够的速度获取多个堆栈,以便检索分析数据所需的所有信息,并将单元保存在Field of View中。
- 显微镜需要允许多次收购
- 目的是在相同的实验条件下(使用相同的采集设置)同时收集对照和突变细胞系。
Dimova承认了这一点和或蜻蜓提供了所有的基本特征,允许表观遗传修饰的实时成像。蜻蜓的速度和灵敏度的结合允许在mESC中获取实时成像数据。
“我更喜欢用。和或蜻蜓旋转圆盘共聚焦显微镜来获取这些延时图像,因为它能够给我实时观察亚核事件所需的分辨率。我还可以查看我的报告程序在整个细胞周期的进展。"
此外,Dimova解释说
“内置的融合反卷积是一个优势,因为它提高了我的图像的分辨率。”
作为整体评论和或蜻蜓:
“该系统非常优化,自动化,使其非常容易获得适合统计分析的大量数据。”
Dimova的目标是分析Polycomb在中心异染色质中诱导的表观遗传修饰,这项工作仍在进行中。“我们发现主要的挑战是染色DNA和保留染色质定位信号的能力。”(例如,使用不会干扰染色质结构的DNA染色剂)。这一结果对于DiMova的研究至关重要:针对泌乳杂象(PCH)确定甲基化报告器的精确定位。
DAPI(或Hoechst)染色均可观察到中心周异染色质。然而,由于DAPI(和Hoechst)是与DNA插入的染料,它们似乎取代了周围的染色质。通过使用Andor的“蜻蜓”,Dimova意识到这种分析只能通过活细胞成像来完成。
现在,Dimova需要对异染色质染色来分析报告细胞的定位或再定位。如何克服障碍?计划是使用在Baubec实验室设计的另一种染色质解读器(报告基因),同时对中心异染色质和报告基因GFP-Cbx7进行染色。Dimova补充说,“我们目前正在使它与我们的细胞兼容。”
作为一部动作电影,我们迫不及待地想看到这个故事的下一个章节,并在MESC中进行了表观遗传修饰的分子知识。祝你好运,Silviya和Meehan实验室;随着结果的收集和分析,请让我们张贴发布!
参考文献
- Reddington, J.P., Perricone, S.M., Nestor, C.E., Reichmann, Youngson N. A., Suzuki M., Reinhardt D., Dunican D.S., Prendergast J.G., Mjoseng H., Ramsahoye B. H., Whitelaw E., Greally J. M., Adams I. R., Bickmore W. A. & Meehan R.R.(2013)DNA低甲基化后H3K27me3的再分布导致Polycomb靶基因的去抑制。基因组Biol.14,R25。
- McLaughlin K., Flyamer i.m., Thomson J. P., Mjoseng H.K., Shukla R., Williamson I., Grimes G.R., Illingworth R. S., Adams I. R., Pennings S., Meehan R. R., Bickmore W. A.。(2019)DNA甲基化指导幼稚多能性的Polycomb依赖3D基因组重新组织。Cell Reports, 29, 1974-1985。
- Villaseñor R, Pfaendler R, Ambrosi C, Butz S, Giuliani S, Bryan E, Sheahan TW, Gable AL, Schmolka N, Manzo M, Wirz J, Feller C, von Mering C, Aebersold R, Voigt P, Baubec T.(2020) ChromID识别染色质标记上的蛋白质相互作用体。NAT BIOTECHNOL。38(6):728-736。