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光谱分辨率是多少?
光谱分辨率是光谱系统分离相邻峰的能力。共聚焦拉曼系统的光谱分辨率主要由以下定义:
- 光谱仪的焦距(焦距越长，光谱分辨率越高)
- 光栅(槽密度越高，光谱分辨率越高)
- CCD相机上的像素大小(像素越小，光谱分辨率越高)
- 入口狭缝或针孔(狭缝/针孔越小，光谱分辨率越高)
- 谱仪的线形保存(=成像质量)
光谱分辨率可以通过实验确定，例如通过测量已知参考样品的峰值分辨率。用于演示光谱分辨率的一个已建立的样品是例如CCl4．
除了少数例外，拉曼线的自然线宽通常大于3厘米－1．因此光谱分辨率在1厘米范围内－1对于大多数样本来说是足够的。
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什么是拉曼效应，什么是拉曼散射?
喇曼效应:
拉曼效应最早是由物理学家钱德拉塞卡拉·文卡塔·拉曼(* 1888，†1970)在1928年通过实验发现并描述的。拉曼效应是基于样品化学键上的非弹性光散射。由于化学键的振动，这种相互作用会导致背部散射光部分的特定能量转移，从而产生独特的拉曼光谱。
拉曼散射:
拉曼散射是一种非常微弱的效应，通常不到百万分之一的激发光子产生一个拉曼光子。拉曼散射可以进一步区分为Stokes散射和Anti-Stokes散射。两者都包含有关材料及其分子组成的信息。
- 斯托克斯散射:光子将能量传递给分子。发射的光子比吸收的光子能量低。
- 反斯托克斯散射:分子将能量传递给光子。发射的光子比吸收的光子有更高的能量。
除了非弹性散射外，还会出现弹性散射。与入射辐射能量相同的弹性散射称为瑞利散射。它不包含有关分子的任何信息，不能用于共聚焦拉曼显微镜中的化学样品分析。
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拉曼光谱包含哪些信息?
拉曼光谱是一种物质的独特指纹。它可以提供定性和定量的信息。
移向高波数(蓝移)的带称为反斯托克斯拉曼带，移向低波数(红移)的带称为斯托克斯拉曼带。通常，斯托克斯位移拉曼带的强度更强，因此用于定性和定量分析。
除了化合物的分布之外，从拉曼光谱中还可以得到更多的性质:
- 峰值强度提供了有关特定化合物数量的信息
- 峰值位移可以识别应力和应变状态
- 峰宽反映了晶体的结晶度
- 偏振态提供了晶体对称和取向的信息
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拉曼技术
什么是共聚焦拉曼成像?
石榴石中流体包裹体的三维共聚焦拉曼图像。不同的颜色代表不同的分子相。
对于共聚焦拉曼成像，共聚焦拉曼显微镜逐点逐行扫描样品，在每个图像像素处获得完整的拉曼光谱。这个过程也被称为高光谱成像。获得的多光谱文件包含了数千到数百万个拉曼光谱信息。软件对这些文件进行分析，生成显示化学成分空间分布的图像。通过在不同的焦点位置(在z方向)拍摄一堆图像，可以创建3D图像。
拉曼分析的样品要求是什么?
拉曼分析可以对各种样品进行，如气体、液体、粉末和固体。只有纯金属可能会造成困难，因为它们是拉曼非活性的。
一般来说，不需要样品制备(如染色或解剖)，拉曼光谱测量可以在原位、体外和体内进行。
拉曼成像的最大适用样本量取决于拉曼显微镜的能力，最大扫描范围取决于集成扫描阶段。通常，样品面积从200 x 200 μ m²到50 x 50 mm²都可以被研究。在样本足够透明的情况下，z方向深度扫描也是可能的。
激发波长对测量有影响吗?
波长对测量结果和可获得的信息有很大的影响。它的影响:
- 拉曼信号:拉曼散射强度与ν成正比4，其中ν为激发激光辐射的频率，即较低的激发波长导致较高的拉曼信号。
- 荧光信号:许多样品在光谱的紫外或蓝色区域激发时荧光较强，在光谱的红色或近红外区域激发时荧光较弱。荧光信号较强，可以掩盖较弱的拉曼信号。
- 空间分辨率:激发波长越短，空间分辨率越高。注意:对于空间分辨率，还需要考虑物镜的NA。
- 样品损伤:对于短波，高光子能量可能导致样品损伤在较低的激光功率比较长的波长。
哪些激光器适合拉曼分析?
适用于拉曼显微镜的激光具有以下特点:
- 高斯光束形状(单纵模TEM00)，使其可以聚焦到衍射受限点上
- 窄线:远低于1厘米的窄线形状－1，以避免拉曼线变宽
- 频率非常稳定(变化< 0.01 cm－1)，以进行高精度的应力测量
- 非常稳定的强度(< 1- 2%的功率波动)，允许准确和可比的测量浓度
- 线偏振，允许观察偏振相关的样品性质
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显微镜
什么是共聚焦显微镜?
共聚焦显微镜原理。
共聚焦显微镜的目的是抑制来自非聚焦平面的光。这首先通过在焦平面上的点照明来实现，其次通过在探测光束路径的共轭平面上的针孔来实现。
由于点照明和检测，一次只能确定来自单个点的信息。为了生成图像，样本被逐点逐行扫描。
与传统的宽视场显微镜相比，共聚焦显微镜的优点是提高了横向平面的分辨率，轴向的高分辨能力，减少了背景信号，并有机会从不同的焦平面收集连续的光学切片来生成深度剖面或3D图像。
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为什么针孔大小很重要?
针孔尺寸是分辨率和信号吞吐量之间的折衷。一方面信号要尽可能高，另一方面空间分辨率要尽可能好。一个小针孔强烈增加深度和横向分辨率。然而，到达探测器的信号减弱了。
什么是共聚焦拉曼显微镜?
共聚焦拉曼成像技术将拉曼光谱与共聚焦显微镜相结合，通过获取每个图像像素处的完整拉曼光谱信息。因此，化学成分在样品中的空间分布被检测和成像。高分辨率共聚焦拉曼显微镜在衍射极限(~ λ/(2NA);通常250 - 300 nm为532 nm激发波长和100x 0.9 NA物镜)。共聚焦显微镜设置还具有出色的深度分辨率(低于1µm)，并允许生成3D拉曼图像和深度剖面。
什么影响共聚焦拉曼显微镜的通量?
共聚焦拉曼显微镜的通量直接影响共聚焦拉曼成像所需的时间量以及系统的灵敏度和能力。它受到各种显微镜部件的影响，如物镜、耦合元件和滤光片、针孔、光谱仪和CCD相机。为了优化吞吐量，系统的每个部分都必须优化以获得最高的传输和效率。
| 高通量系统 | 低吞吐量的系统 |
| 高质量目标 | 低质量目标 |
| 使用单一光纤的波束引导 | 使用反射镜的波束制导(例如3个反射镜) |
| 镜头的光谱仪 | mirror-based光谱仪 |
| 背光式CCD照相机 | 前照式CCD照相机 |
532 nm激发波长优化的高通量系统与低通量系统。在这两种情况下，都忽略了由针孔引起的吞吐量限制。
我实验的正确目标是什么?
在选择合适的物镜时，应考虑所有的测量条件。一个好的显微镜物镜在500nm波长可能有80-90%的透射率，但在900nm波长只有40%或更少。样品和物镜之间的工作距离以及在低温或液体等特定条件下进行测量的机会也是决定该决定的重要因素。此外，成像误差的校正，如色差，是一个重要的质量特征。
除了放大倍率，数值孔径(NA)起着至关重要的作用:在测量条件下，使用NA最高的物镜可以获得最高的采集效率和最佳的空间分辨率。NA还定义了激发点的分辨率和功率密度。然而，如果样品的地形要求在z方向上有更大的采集范围，那么较低的NA是有益的。
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光纤耦合拉曼系统的特点是什么?
光纤耦合显微镜系统使用单模光纤将光从激光器传送到显微镜。透射光保持TEM00模式，并独立于激光功率衰减保持其高斯特性，从而允许衍射有限分辨率。
探测光束路径中的多模光纤可传输高达90%的拉曼信号。相比之下，使用三面反射镜的Al-mirror光学系统在532 nm激发波长下的透射效率仅为78%左右。如果使用的镜子数量增加，透光效率会进一步下降。因此，光纤的使用特别适用于超高通量显微镜系统。
光栅是如何影响测量的?
光谱仪中的光栅通过使每个波长以不同的角度偏转，将信号分散到CCD探测器上。每毫米沟槽的数量决定了色散特性。高数量的沟槽/毫米(线/毫米)导致高色散，从而高分辨率，通过分布信号在更大数量的CCD像素。
为了优化效率，光栅通常在特定波长“发光”。这意味着沟槽是有角度的，因此光栅效率可以达到80%的第一衍射级。光栅效率决定了光谱仪通量的上限。
在多个光栅之间切换通常是有用的:一个覆盖整个拉曼光谱(-100到3600厘米)－1)和高分辨率光栅，传输约1厘米－1光谱分辨率。
哪些CCD探测器可以使用?
CCD(电荷耦合设备)相机是探测光束路径中的最后一个元素，它将到达芯片的光子转换为电子，然后是一个可以在软件中使用的信号。CCD相机是拉曼显微镜的重要组成部分，选择正确的CCD极大地影响仪器的性能。量子效率(QE)是这些相机的关键要素。QE是检测到的光子占入射光子总数的百分比。下图为三种典型相机的室温qe曲线。
常用ccd的量子效率。
拉曼光谱常用的ccd有:
- 在可见范围内，背光CCD相机是相机的选择。它具有较高的量化宽松，提高了仪器的吞吐量。
- 正面照明的ccd确实有更广泛的工作范围，但与背面照明的ccd相比，QE较低。它们还显示出非常低的暗噪音。
- 对于探测波长大于约850-900nm的波长，深耗CCD相机是最佳选择，因为它们具有nir优化涂层和该范围内的最佳QE。这种类型的相机显示出比前面提到的更高的暗噪音。
- 背光emccd(电子倍增CCD)是目前市场上最灵敏的光谱探测器，信号的总放大倍数可达1000倍。因此，可以进行超快速拉曼成像(每秒采集约1300个光谱)。
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先进的拉曼技术和组合
什么是共振拉曼?
在共振拉曼(RR)散射中，激发波长被选择落在被研究分子的吸收带内。这可以提高拉曼信号的强度和改善信噪比。RR还有一些优点:首先，只有那些与电子激发耦合的模式才会共振增强，这导致光谱复杂性的大幅降低。第二，RR可用于选择性地研究混合物中的特定分析物，通过调谐激发波长到特定分析物的吸收带。RR的缺点是不仅是非弹性散射的光，而且还观察到增加的荧光和发光。
什么是表面增强拉曼光谱(SERS)?
Fleischmann等人于1974年首次观测到表面增强拉曼散射。其原理是，靠近测量位置的贵金属纳米颗粒增强了拉曼散射。同时，拉曼光谱的复杂性通常减少到突出的标记波段。SERS已被证明可用于吸附在银、金、铝、铜、钯和铂等金属结构上的分子，并且金属结构的表面粗糙度与SERS增强之间存在相关性。市售的SERS基板现在为进行SERS实验提供了可靠和有效的来源。
SERS可以通过使用与分子能级共振的激光激发波长(表面增强共振拉曼散射(SERRS))与共振拉曼耦合。
什么是尖端增强拉曼光谱(TERS)?
尖端增强拉曼光谱(TERS)能够获得远低于衍射极限的横向分辨率的化学信息。TERS测量技术是表面增强拉曼散射(SERS)与扫描探针显微镜(SPM)技术的结合，如原子力显微镜(AFM)。因此，它结合了AFM的高空间分辨率和拉曼散射的化学敏感性。
为了获得TERS效应，可以使用金属涂层的afm尖端作为纳米结构。激发激光聚焦在尖端尖端以增强尖端附近的拉曼信号。因此，横向分辨率取决于尖端尺寸(10 - 20nm)。TERS效应被认为是基于表面等离子体激元和化学共振效应，导致电场增强和拉曼信号强度增加。TERS尖端照明通常从上方、下方或侧面应用。
尽管TERS受到越来越多的关注，但其实际应用领域仅限于少数样本和科学问题。此外，商业TERS-tips的可用性仍未确定。此外，金属涂层尖端的成本在很大程度上增加了实验的总费用。
TERS的应用例子可在下列刊物中找到:
G. Rusciano等人，结合尖端增强拉曼散射和先进统计工具的枯草芽孢杆菌孢子的纳米级化学成像。ACS nano8, 12300-12309(2014)。
A. Weber-Bargioni等，同轴光学天线扫描探针在介电基材上的高光谱纳米级成像。纳米快报11, 1201-1207 (2011)．
如何进行偏振相关的测量?
偏振相关测量允许研究拉曼光谱中特定峰的偏振相关活度。这可以用来分析分子取向和几何，例如晶体晶格，液晶，非晶材料，或聚合物。
因此，激发光的偏振可以在焦平面上以不同的角度旋转(如平行、垂直、圆形等)，然后拉曼散射光可以在相对于激发光偏振方向的任何方向上进行分析。
什么是低波数测量?
不同MoS的低波数拉曼光谱2层。
大多数光谱系统允许分析低至100 - 200厘米的波数－1．低波数测量提供了来自瑞利线附近的斯托克斯和反斯托克斯拉曼信号的额外光谱信息。因此，一个特定的耦合器与显微镜设置集成，允许在波数低于10厘米的拉曼光谱的获取－1．低波数测量通常应用于制药研究、聚合物研究、半导体研究、纳米碳研究和结晶度的研究中。
关于石墨烯研究中的低波数测量的出版物:
丛春，余涛，折叠石墨烯层间超低频剪切模增强。Commun Nat。5,4709(2014)。DOI: 10.1038 / ncomms5709
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什么是地形共聚焦拉曼成像?
地形共聚焦拉曼成像可以对粗糙、倾斜或不规则形状的样品进行3D化学表征，并且可以沿着表面或在距离表面设定的距离上精确地进行，而不需要样品制备。
地形传感器的工作原理是共聚焦色度传感器原理:白光点源通过具有很强线性色差的透镜系统聚焦到样品上(深色度透镜系统)。因此每种颜色都有不同的焦距。样品反射的光通过针孔聚焦到传感器顶部的专用光谱仪上。由于在样品表面只有一种特定的颜色被聚焦，所以只有这一种光可以通过共聚焦针孔。因此，检测到的波长与表面形貌直接相关。
在x-y平面上扫描样品可以得到样品的地形图。有了这张图，样品的表面可以在整个测量过程中保持焦点，而不考虑其地形。
光学传感器以亚微米精度控制物镜和样品表面之间的距离。因此，在长积分时间的测量过程中发生的任何变化都被补偿，从而产生清晰和详细的图像。
什么是超快共聚焦拉曼成像?
使用EMCCD探测器，可以进行超快共聚焦拉曼成像。单张拉曼光谱的采集时间可低至760微秒，每分钟可采集1300张拉曼光谱。由于共聚焦拉曼图像通常由数万个光谱组成，新选项将完整图像的总采集时间缩短至仅几分钟。例如，一个由250 x 250像素= 62,500拉曼光谱组成的完整的高光谱图像可以在不到一分钟的时间内记录下来。
超快拉曼成像由于大大缩短了测量时间，特别适合于大面积共聚焦拉曼图像。精细和敏感的样品，如活的有机体，也受益于减少测量时间和低水平的激发功率所必需的。
什么是近场拉曼成像?
近场拉曼成像是一种结合显微技术，将化学拉曼信息与高分辨率扫描近场光学显微镜(SNOM)连接起来。它可以获得高分辨率的共聚焦拉曼图像。横向分辨率可达60 nm。
近场拉曼成像原理
激发激光通过snm尖端聚焦，在孔径远侧产生一个倏逝场(近场)。当样品在压电驱动扫描台上移动时，透射光逐点逐行进行光谱检测，以生成高光谱图像。透射光的光学分辨率仅受孔径直径的限制(低至60 nm)。使用与AFM接触模式一样的梁偏转设置，可以确保悬臂始终与样品接触。通过这种方法，地形与近场拉曼测量同时被记录。
有哪些可能的拉曼组合?
共聚焦拉曼成像是一种非破坏性成像技术，因此可以与其他技术相结合。
通过使用不同的成像技术研究样品，结果中包含的不同信息有助于更全面的样品分析。此外，这两种成像技术的优点可以结合起来提高分辨率。
以下是一些常见拉曼组合的例子:
拉曼和AFM
通过将共聚焦拉曼成像与AFM相结合，可以很容易地将样品的化学性质与表面结构和力学性能联系起来。这两种互补的技术可用于组合拉曼- afm显微镜更灵活和全面的样品表征。
拉曼和AFM图像来自同一样品区域的聚合物共混物。
拉曼和斯诺姆
将拉曼与SNOM(扫描近场光学显微镜)相结合，将化学表征与衍射极限以下的光学成像联系起来。如果通过SNOM尖端进行拉曼测量，可以生成横向分辨率低至60 nm的高分辨率图像。
拉曼和扫描电镜
拉曼-扫描电镜组合是一种新的相关显微技术。扫描电镜检测到的纳米范围内的结构现在可以与来自同一样品区域的化学拉曼成像相关联。
扫描电镜图像与岩石样品的拉曼图像镶嵌。
