显微镜学校第9 & 10课-超分辨率显微镜

第九课成绩单

我的名字是Siân Culley，我将给你们上两节关于超分辨率显微镜的课，非常基础的技术，让你们掌握显微镜方法的全部内容。我个人目前是伦敦大学学院分子细胞生物学MRC实验室的博士后研究助理。过去十年的大部分时间里，我一直在使用超分辨率显微镜，这让我有点担心，让我觉得自己老了。

好了，这只是我们接下来几堂课要讲的内容的一个概述。我们将讨论分辨率的基本原理，是什么限制了它，以及为什么我们需要这个叫做超分辨率显微镜的东西。然后我们将深入研究我们可以使用的三种主要技术。分别是SIM, STED和SMLM。我保证随着我们的深入，这些首字母缩写会越来越清晰。

最后，我们将通过讨论这个领域目前的进展，超分辨率显微镜目前面临的挑战，以及在未来几年内你会看到什么，超分辨率显微镜的前沿是什么。首先，我们先来看看细胞生物学中的大小尺度。我想在座的大多数人都是某种类型的细胞生物学家。我非常喜欢这个动画，因为它向我们展示了我们对细胞感兴趣的全部内容。所以，在最小的一端我们有病毒，上升一个数量级，然后我们有，例如，细菌。先是细菌，然后是另一个数量级，我们会有真核细胞，我们会开始变得更大更复杂。

所以，如果我们在做荧光显微镜，我们感兴趣的尺度范围非常大。所以你可能想要观察整个细胞，但你可能想要观察非常小的物体，如病毒或大细胞内的小结构，如线粒体或其他细胞器。首先，让我们想想是什么限制了我们用荧光显微镜能分辨的最小物体，我们的限制是什么?

限制分辨率的是衍射，所以它被称为衍射极限。所以，我在这里给你们展示的是一束激光束穿过一个狭缝，你们可以在底部看到，这是狭缝，这是激光束之后的样子。现在，假设我们想试着把这个点变小，很明显你要做的就是把这个缝变小，把它压下去。我们希望这能让另一边的激光光斑变小。我们来看看当我们关闭激光狭缝时中间的这个点会发生什么。它变小了，但令人担忧的事情发生了。我们的斑点实际上变得更宽，并再次扩散开来，这有点违反直觉，也出乎意料。

这是因为发生的是衍射。在左边，如果我们有一个平面波，光是一种波，我们有一个平面波入射到一个很大的缝上，然后平面波就会传播出去只是被缝截断了。然而，如果我们开始把狭缝变小，接近波长的尺度，那么实际上发生的是我们的波前展开，所以它变成了一个圆形的波前，我们不再有平面波入射。所有的波都会发生这种情况。这是一个发生在海上的很好的例子。这个视频显示，在这里的某个地方，有海浪涌进来，同样是一个直波阵面。它们穿过这道小墙。如你所见，它们以圆形波前的形式扩散开来。这就是光通过狭缝时所发生的情况。但当这是一个可爱的海滩，我们都可以想象我们是，而不是学习显微镜时，这是更容易想象的。

所以，如果我们考虑我们的显微镜，然后我们有一个像右边这样的情况。所以我们的光源，在这种情况下，它是一个荧光团，所以那里的微小GFP发射平面波前。这条缝本身就是我们的目标。这个小光圈就是物镜的光圈。这就是导致衍射和光在显微镜下扩散的原因。

让我们给它一个数字，我们用荧光显微镜能看到的最小的东西是什么?这里有一个小小的绿色荧光蛋白，我们把它想象成一个点状光源。绿色荧光蛋白分子本身，我认为，大约5纳米大小，这是非常非常小的，我们都知道。当它穿过物镜时，你得到的不是一个5纳米小的点光源，而是一种叫做通风盘的图案，或者说430是点扩散函数。

这就是衍射穿过圆形孔径的干涉图样，就像我们的物镜一样。你可以看到它的中心是极大值，然后是向边缘延伸的较小的极大值。中心最大值的大小大约是300纳米，对吧?但是是什么限制了这一点呢?为什么是300纳米?为了解释这一点，我们请到了我们的朋友欧内斯特·阿贝，他是一位德国物理学家，留着很好看的胡子。阿贝提出了这个，他说显微镜中两个物体之间可分辨的最小距离，如果你把两个物体放在一起，你能看到的距离有多小，等于光的波长除以2再除以sin。sin，它到底是什么?它实际上在你的物镜上，它是物镜的数值孔径。

所以，如果我们代入一些数字，我们得到600纳米的光，所以红光，数值孔径是1.4，那么我们的分辨率大约是214纳米。好的。这给了我们一种最小物体的数值表示或者是我们在光学显微镜下能看到的最小可分辨距离。给大家举个例子。这是我画的一个结构，你们应该能看到这是一对越来越近的线，一端相隔800纳米，另一端相隔10纳米。如果用受衍射限制的荧光显微镜给这个物体成像，就像你们在这里看到的，然后你会得到像这样的东西。

所以在衍射极限之上，你仍然可以分辨出两条不同的直线。但是当我们达到衍射极限时，在这个模拟中大约是210纳米，这时这两个物体就不再是独立的了，它们模糊成一个了，对吧?这就是分辨率极限。例如，在最小的距离中你仍然可以分辨出有两个物体而不是一个。你可以想象这是非常非常有问题的，对吧?所以，对于这个模拟，我们有情境，我们会说，“好，酷。嗯，我很确定这是某种V形结构。”但如果我们没有这种低分辨率结构的附加环境，我们可以解决，如果我们只有这个，你不知道在模糊中是什么，这就是为什么分辨率是一个问题。

这是细胞生物学中不同大小尺度的另一个示意图。我们想要的是为这些不同的物体找到合适的成像技术。所以，荧光显微镜很棒，我喜欢它。这真的很好，因为我们可以观察活体结构，活体样本，我们可以观察动力学，我们可以让我们的样本表达荧光蛋白，我们有很多标记工具可供我们使用，荧光显微镜有很多优点。但当然，最大的缺点是它的分辨率，如你所见，我限制在300纳米左右。

当然，我们也有电子显微镜。电子显微镜也受到衍射的限制。但是它绕过这个的方式是波长要小得多。可见光的波长是几百纳米，大概在400到700纳米之间。电子显微镜使用的是波长非常非常小的电子束。当然，这就是为什么电子显微镜，即使受到衍射的限制，也能得到很高的分辨率。所以，通过粒子平均，它们在某些情况下可以达到几埃。

现在，在电子显微镜中这种难以置信的分辨率的代价是，当然，你不能使用所有的标签，你不能有活的样本，你只有一个死的样本它经过了非常极端的样品制备过程。你有荧光显微镜中所有可爱的荧光蛋白，染料和标记技术。所以，超分辨率显微镜的存在就是为了填补这个空白。所以，在我开始之前，我们可以快速比较一下荧光和电子显微镜。所以，就像我说的，荧光显微镜，你有很多标签，它是活细胞兼容的，样品制备非常简单，我们可以得到非常好的，高时间分辨率和可感知的动态过程。但在空间分辨率方面，电子显微镜大大胜出。我们有一个，两个，三个数量级，也许，更高分辨率的电子显微镜。

好的，我想说的是超分辨率的存在本质上是为了填补这个空白。我们开始吧。因此，超分辨技术基本上是试图将荧光显微镜的分辨能力扩展到电子显微镜所能达到的水平，或者是这一目标的一部分。重要的是，超分辨率显微镜技术希望保留与荧光显微镜相关的所有优点。所以它试图使荧光显微镜接近电子显微镜的分辨率，而不放弃所有这些好处。如果我们现在看一下这个表格如果我们用超分辨率代替它，我们还有很多标签可以用吗?是的。它与活细胞兼容吗?是的，但在理论上，这是我们在接下来的几次讲座中会讲到的。示例准备仍然非常简单。 And the temporal resolution can suffer a bit. And, of course, we'll talk about why this is. But you'll still get quite good temporal resolution in super-resolution microscopy, down to kind of seconds maybe, which is still pretty good.

当然，我们在这里都在寻找的是空间分辨率。超分辨率技术现在可以让我们获得20到150纳米的分辨率，这取决于我们使用的技术。这很好。我们还没有达到那种真正的纳米尺度的电子显微镜，但我们肯定比传统的荧光显微镜要好。

所以，希望从介绍部分，你们能理解为什么荧光显微镜的分辨率是有限的，是什么限制了它，以及荧光显微镜和电子显微镜之间的各种比较。好了,好了。现在我们来看看超分辨率。目前有三种主要的超分辨技术，结构化照明显微镜，简称SIM，受激发射耗散显微镜，简称STED，和单分子定位显微镜，简称SMLM。在接下来的时间里，我们会遇到更多的首字母缩略词，不管这需要多长时间。但这是你需要记住的真正的三大要素。

这是90年代初开始的第一个迹象。从那时起，它们就开始流行起来。2014年，我相信，诺贝尔化学奖被授予了一些单分子定位显微镜的先驱，斯蒂芬·海尔，威廉·莫尔纳和埃里克·贝齐格。所以，这就是说这些超分辨率显微镜技术是一件大事。所以我们会一个一个地讨论它们，讨论它们是如何工作的，它们的有趣之处，我们什么时候可以使用它们，它们的运行参数是什么样的条件。

我们将从结构照明显微镜开始。我不是要警告你们，而是要承认是的，承认这个事实这是我个人很难理解的。在我看来，这是最不容易理解的。所以如果不合理也不用担心。我经常使用这种方法，有时我仍然坐在那里思考，“我真的理解了吗?”这有点像在戏弄你的大脑。但我们会尽力的。如果你不明白，别担心，我提供了一些回顾和其他资源，如果你想稍微慢一点，你可以去那里。好吗?

所以，在我们开始讲结构照明显微镜之前，我只是想确保我们已经熟悉了图像中频率的概念。这是一个固定细胞中的Mitotracker的图像。这是我们作为显微镜学家非常熟悉的图像，这是我们在空间领域的结构。每个像素都是一个物理距离。我们可以把大小和图像中的每一个结构联系起来。表示完全相同的信息的另一种方法是在频域中。所以这是倒数。我们通过傅里叶变换来实现。如果我们对图像进行傅里叶变换，如果你用图像j，比如斐济，你可以对图像做这个，它叫做FFT，快速傅里叶变换，如果你感兴趣的话。如果你在空间域上对我们的结构做这样的处理，你会得到这个看起来很奇怪的图。

这是在频域中表示相同的信息，对吧?在这个图中，当然，你可以通过对这样的东西进行傅里叶反变换来回到最初的结构。通过这些傅里叶变换，你可以在空间域和频域之间来回跳跃。这幅图向我们展示的是，本质上，它绘制了图像中不同的空间频率。所以高频率是靠近边缘的低频率是靠近中间的。所以较低的频率是距离或尺寸的倒数。所以，这个地块的中心包含了我们的大型结构，而较小的结构，更精细的细节，则位于边缘。在这个中心环之外，就是高频噪声超出衍射极限的地方。

就像我说的，我们有一个中间的圆，所有的空间信息都包含在里面。这就是显微镜的频率截止或者衍射极限。好吧?所以，在高频噪声之外，在中间，低频，所有的大的，肥厚的结构，接近边缘，这些都是非常精细的细节。为了给你们展示这个，我要做的是给你们展示一个视频，在这个视频中我们从傅里叶定义域的不同部分来制作图像，只是为了让你们习惯这是相同的信息。傅里叶变换的不同部分在现实生活中代表不同大小的结构。

这是我们的傅里叶图像，我首先做的是做一个傅里叶反变换，另一个F代表快速。这个圆内的频率的快速傅里叶反变换。所以，在最高频率下，6.51微米。如果我这样做，你可以看到，是的，确实，这是大脂肪结构，这是低频信息。如果我播放这个视频，我要做的就是每次增加更多的频率。当我添加这些频率时，你应该看到的是，你在图像中得到越来越多的细节，对吧?所以在傅里叶空间越远，图像的细节就越多。这并不一定是SIM的一部分，这是任何荧光成像的基本特性，对吧?只是为了让你们适应图像和频率是一样的。它们互为反比。 Okay, great.

这和SIM有什么关系?好了，再放一遍，为什么不呢?现在我们知道要找什么了。好的。这是我最喜欢的漫画之一，XKCD。别担心上面说了什么因为这段录像会被录下来，我觉得我这辈子不需要那种罪证。但是我们这边的小伙子说，“我给我的电脑屏幕拍了一张照片。为什么照片上有这些奇怪的彩虹图案?”那个坐在扶手椅上的聪明女人说着，唱着，“当一个网格与后面的另一个网格不对齐时，那就是moiré。”

好的。如果你不熟悉漫画中这两个人在说什么，那就是这个。所以这里我们有两张照片，一个男人穿着一种相当古怪的条纹衬衫，和一个波纹似的谷仓门。你能看到的是这些奇怪的彩虹图案，有点奇怪，就像在这件衬衫和谷仓门上面的油溢出的图案。例如，你在谷仓图像的其他部分看不到它们。这些奇怪的环状脂肪图案是moiré干涉图案。这些moiré模式是两种模式的结果，它们有更高频率的干扰。

那么，每种情况下的两种模式是什么?在这种情况下，我们有衬衫上的条纹图案，这是一种高频图案。当我们拍照的时候，你也会得到另一种模式，对吧?你在相机里有一个像素数组。这是我们的第二个高频模式。所以衬衫条纹的结构干扰了我们相机像素网格的结构，你得到了这些较低频率的moiré条纹，它们被称为，这种干涉图案。这扇谷仓门也是一样。再一次，我们在这幅图像中得到了高频图案，这是瓦楞门，我们还有另一个高频图案，这是我们的像素和我们相机中的阵列，我们拍照，除了得到我们的其他空间信息，我们还得到了这两个高频图案在moiré条纹上的干扰。

这里有一个小视频，再次说明，moiré在这种情况下，边缘是令人讨厌的。但你可以巧妙地利用它们来找到更多关于你的结构的信息。这里有两个高频模式。一个里面有某种结构，但你看不清它是什么，另一个只是一个直的网格，明白吗?只是网格线。你可以看到我重叠的地方，你可以看到moiré条纹，这是较低频率的信息。好的。让我们看看如果我让一个高频模式越过另一个会发生什么。你可以看到，在这些moiré条纹中，你实际上开始得到我们高频模式之一的信息。在这种情况下，因为我是一个疯狂的爱猫女士，它是一只猫的照片。 And this is really cool.

所以你有一个未知的高频模式，我们移动一个已知的高频模式，只是把它条带化，我们突然从两者的干涉中得到所有有趣的信息。因此，低频moiré模式包含关于这两个底层组件的信息，明白吗?这一点非常重要。它是两个干扰空间的频率的乘积。那么我们到底如何在SIM中使用这个来获得分辨率呢?你要做的就是思考，好吧，模式。我有一个未知的高频模式想要研究。这是荧光分子在我的样本中的分布。我如何生成一些moiré边缘来告诉我们更多的信息?好吧，让我们用一个已知的高频模式来照亮它，例如，一个条纹照明场。 So, instead of illuminating the flat field, we illuminate our sample with a striped field. And this results in a kind of image that looks like this, which are like, ugly, why would I do that? But this contains moiré information. This contains that interference information. And if you have a little look at the Fourier transform over here, you can see something we didn't see earlier, which are these little spots in the frequency space. And this is from the moiré interference, and this contains information about both patterns, on the kind of high-frequency level.

但重要的是，记住，我们不是在显微镜的分辨率支持之外进行检测。把这个moiré模式引入到可解域中?即使是低频信息，它也包含了样本中较高频率的信息。这就是SIM卡获取的原理。这是一种广角显微镜技术，你把光线通过某种制版机，明白吗?这可以是一个衍射光栅，也可以是一个空间光调制器，你可以用这些干涉做一些有趣的事情来产生某种规则的图案。你基本上移动这个网格图案的相位和旋转，并为你的结构拍摄一系列的图像。

所以，对于照明的每一个旋转和相位，你会得到不同的moiré模式，你实际上可以看到它们在傅里叶空间中旋转。这就是酷。我们如何使用它来提高分辨率呢?现在我们有了所有这些moiré图案它们是我们的衍射干扰高频率的图像和我们的网格。我们能做的是你可以把它想象成一系列的联立方程。实际上，在相同的算法中，这都是在频率空间中完成的，所有的SIM计算都是在频率空间中完成的，但你不需要担心这个因为大多数时候这些都是为你完成的。

为了理解它，我们要在真实空间中考虑它。让我们想象我们有了第一个moiré模式，我们知道那是我们不知道的真实结构一个非常高的分辨率与已知的照明模式卷积。好吧?我们得到了一个方程。照明模式一。如果你把它和这个结构卷积，你就得到了moiré模式一。在这个方程中，你知道两件事。然后，假设你旋转你的照明，你得到一个新的moiré干涉图案，你，再一次，知道了你的照明图案，你的结构是一样的，对吧?所以，基本上，如果你把所有的旋转和相位结合起来，你可以做25张图像。从本质上说，你得到了一个大的联立方程类的矩阵，你得到了观察到的带有低频信息的moiré干涉模式，你得到了一个你知道的高频模式，现在你可以用这个组合来反计算你的实际结构用比以前更高的分辨率。 Okay?

这就是它的样子如果我运行所有这些moiré模式，通过重建算法，这些发光网格模式，然后我们从衍射有限的图像到中间的SIM重建。你可以看到，如果我们一开始只看这两张图片，你会得到一个很好的提高分辨率。例如，我们可以看看这里的细节，你可以看到，我们开始看到这些线粒体的管腔，例如。如果我们看一下傅里叶变换，我们的SIM重建的频域图像，你可以看到我们现在填满了更多的频率空间，对吧?这个虚线圆是图像的原始分辨率极限，这就是衍射极限图像的傅里叶变换信息所在的位置。我们现在得到了更远处的频率。所以我们正在深入到更高频率的领域。在我们的图像中，它们的分辨率更高。

我们的SIM圆，就像这里一样，是衍射受限圆半径的两倍。SIM卡的分辨率提高了一倍，非常酷。综上所述，SIM的主要特点是，它是一种广泛的技术，它可以很好地应用于活细胞。这是因为它并不在乎你用的是什么荧光分子。你可以在SIM中快速使用荧光蛋白。网格图案旋转不需要太长时间。所以它不需要花费大量的时间来创建SIM图像的原始数据，这意味着你有一个相当好的时间分辨率，通常大约一秒。

例如，多色成像也非常简单。再说一次，它对荧光没有任何奇怪的反应。它没有任何奇怪的荧光团。它所做的就是生成干扰模式然后重建这些模式，明白吗?这些都是SIM卡的主要特征。简单看一下SIM显微镜的一些应用。bob综合app官网登录很多商业制造商都有SIM显微镜，例如蔡司有Elyra，尼康有N-SIM, GE/Applied Precision，我想他们的名字是，有DeltaVision OMX。有很多商业的SIM解决方案，如果你有胆量，你也可以自己开发。但这只是SIM如何使用的一个例子。

所以你可以将SIM扩展到三维空间。由于时间关系，我现在不打算讲这个，但它是可行的。这里有几个例子关于三维和多色SIM是如何被用来观察核组织的。这是Lothar Schermelleh团队的成果。这是非常漂亮的影像。你可以在这里看到，他们所做的是对DAPI成像，所以，染色染色质和核薄片。你可以在共聚焦显微镜图像中看到它非常酷。你可以看到拉敏在染色质之间。如果我们进入SIM，你可以看到更高分辨率的信息，你可以看到在染色质小球之间形成的小管。这很酷。

还有一个最近的例子，这是3D SIM成像显示了一种DNA断裂修复蛋白，在断裂部位周围形成了一个外壳。这是断裂点的小标记。这是DNA修复蛋白。为了在修复过程中保护该部位不受损害，并确保突变不会传播，等等，3D SIM被用来说，实际上，是的，这些是蛋白质。这53bp在这个微小的DNA断裂点周围形成了一个三维的保护壳，这非常酷。

所以，就像我说的，SIM可以很容易地用于活细胞成像。在左边，我们有一个t细胞免疫突触成像的例子。我们看到的是稳定形成的免疫突触其中肌动蛋白被绿色荧光蛋白标记。这是SIM每800毫秒成像一次，非常快。你可以看到的是你可以看到，例如，这个免疫突触内肌动蛋白的流动和量化的速度和方向。

右边这个很酷。这是SIM硬件用于活体树突棘的成像。所以，你可以想象，这是相当具有挑战性的。但是再一次，你可以看到反卷积广域成像和活体老鼠的荧光标记树突棘的SIM成像之间的区别，再一次，这非常非常酷。那么，SIM显微镜的局限性是什么?

一个很大的限制是相对于衍射极限你只能将分辨率翻倍。这样做的原因是我们所使用的图案也受到衍射的限制。如果我们可以用超出衍射限制的图像，我们就可以进一步提高分辨率，但我们不能，衍射总是限制我们。如果你通过了所有的SIM max，这有点痛苦，然后你从另一端出来，好吧，你可以把SIM的分辨率最大化翻倍。

现在，从理论上讲，你可以用非线性SIM这样的技术更进一步，你可以用饱和荧光产生谐波，你可以用可光切换的荧光蛋白，来获得更多的信息。但那不是塑料SIM卡。当然，一旦你开始用高强度饱和荧光，那么你就开始失去活细胞成像的好处，例如。SIM的另一个很大的限制或警告是重建，你把原始图像通过重建算法得到最终图像，那些很容易产生伪像。左边是一个很好的SIM重构的例子来自我们之前看过的数据。在右边，我故意让一些重构参数变差，我做了错误的选择。

你可以看到它对图像做了一些可疑的事情，如果你不是SIM卡用户，你可能不会注意到。例如，这里的线粒体结构，你可以在重建图中看到，它只是一种小管。然而在我们的平衡重建中，同样的结构突然看起来像两个更薄的，交织在一起的结构。这是令人担忧的，这是你需要非常小心的。这里还有一个例子。所以，如果你有失焦荧光，举例来说，SIM只适合非常平坦的样本，它不适合厚的组织，失焦荧光是一件真的可以毁了你一天的工件。

你可以在这个例子中看到，所有这些小的晶格假象出现在图像中。这就是我们在SIM中所能做到的。希望您能够理解，如果您消除一个带有模式化信息的样本并生成moiré条纹会发生什么情况，SIM如何使用它来提高分辨率的基本原理，SIM的一些主要优点和缺点，以及它在哪些地方是难以理解的。这里有一些资源，可能会有帮助，如果你想回去坐下来，看看数学，更深入地了解SIM是如何工作的。

好的。下一个我们要讲的技术是受激发射损耗显微镜，简称STED。所以STED是这种共聚焦超分辨显微镜技术中唯一的三种主要技术，SIM和SMLM都是宽视场，STED是共聚焦。让我们复习一下共聚焦显微镜。在共聚焦显微镜中，你有一个激光光斑扫描我们标记的样品。假设这是一个模拟。假设这是我们的标记样本，我们有一个激发束扫描我们的区域，在这个模拟中会快得多，但你们应该明白。

每次我们的光束经过标记的样品时，就会发出荧光，你可以在这里看到。所以这里没有结构。当我们的光束经过结构时，我们会得到一些发射的荧光。发射出的荧光发生了什么?我们没有得到这个结构，我们只得到来自光束位置的光子总数，这些光子进入了我们的PMT。低数，高数，等等。这个数字被分配到每个光束位置，也就是你最终编辑的图像中的每个像素。太好了。希望这不会太令人震惊，这很好很熟悉。

那么，是什么影响了共聚焦显微镜的分辨率呢?现在，我们的扫描光斑，当然，有一个有限的直径，因为通过光学衍射。我们回想一下我们展示的那种狭缝视频，这就是我们显微镜中发生的事情，我们不能通过缩小狭缝或缩小物镜来缩小扫描点。

那么，这对我们的决心有什么影响呢?举个例子，当我们的扫描光束停留在这个像素上时，尽管图像中这个位置下没有任何荧光团，但光束的边缘实际上仍然是距离相当远的激发态分子。所以当我们看我们的图像时，它不是零荧光，它实际上有一个荧光值。所以我们的光斑大小有限，意味着离光斑中心相当远的荧光团被激发，这导致分辨率不高。

在显微镜下，我最喜欢做的一件事就是假装自己是物理学之神。如果我是物理学之神，我不会摆脱衍射。我会说，“比如说，如果我们把我们的斑点变小会怎么样?”这是我们的极限，这是衍射的物理极限，光斑直径。好了，回到物理学之神，也就是我。如果我把这个点变小会怎样?那看起来像什么?当然，如果你有一个更小的光斑，那么，对于相同的位置对于相同的像素，光斑在相同的位置。但因为它不是那么脂肪，你不会在很远的地方激发荧光分子，你会得到分辨率更高的图像。

好的。所以，STED所做的是，当然，我们不能让光斑变小，衍射说不行。STED所做的是利用一些巧妙的照片物理原理创造出一个更小的斑点的效果。所以，在STED显微镜中，我们有一个高斯形状的激发束，就像在共聚焦显微镜中一样，所以，中间是强的，外围是很厚很暗的。我们总是会思考在这个位置发生了什么。STED的作用是将第二束激光射入与共聚焦点重合的地方。它的形状像甜甜圈，如果我们称它为损耗束的话。那个测试光束，损耗光束，是一样的，它是这个甜甜圈形状的光束。它的作用是阻止光束强部分的荧光。好吧? So we're going to overlap these two beams, like this.

因此，荧光在甜甜圈光束的强区域被阻挡了。所以，在这个束的外围，我们仍然从RA位置的高斯型激励束得到激励。但这时STED光束说:“不行，不能用荧光。”所以在那部分实际上没有荧光。当然，唯一允许荧光的途径是甜甜圈中间这个暗淡的地方，也就是中间这个地方，它看起来很像扫描你样本的一个小点。因此，当扫描光束穿过样品时，只能从扫描光束路径的中心区域检测到光子。这有点类似于有一个更小的扫描点。

那么，STED是如何做到的呢?这到底是怎么回事?这个可以关闭或抑制荧光的魔法是什么?我们将快速地看一下这背后的照片物理。首先，我们要考虑的是甜甜圈中间发生了什么。我们的激发光束是强烈的，但我们的测试光束是暗淡的。

这些抽象的线代表的是荧光分子的能级。所以在下面这里，我们得到了分子的基态有一些次振动能级。这里我们得到了分子的第一个激发态，同样，还有它的次振动能级。分子是惰性的，所以，在光束击中它们之前，它们会处于前面的状态，处于能量最低的状态。激发光从甜甜圈的中心进入，能量被分子吸收，被提升到激发态。在很短的一段时间后，我们说的是皮秒或更短的时间，我们得到了振动弛缓。然后，过一段时间，我们得到自发发射，或荧光从激发态的较低振动能级回到基态。

从高能量到低能量的转换过程中释放的能量以光子的形式释放出来。这就是你能检测到的荧光。然后你得到振动弛豫，我们准备好进入另一个循环。所以，希望这不是陌生的。当然，如果我们考虑荧光分子的光谱，如果是绿色分子它会在激发处激发，比如吸收峰。然后我们会探测到所有这些红色荧光，所有这些波长较长的荧光进入我们的PMT来制作我们的图像。

好的。这和普通的共聚焦荧光显微镜在光斑中心所发生的事情是完全一样的。好吧。那么在光束的外围呢?现在我们有了激发灯，还有STED灯。好吧?所以我们的STED光束现在强度很大。首先，它是完全一样的。所以基态的分子吸收了激发光，它被提升到第一激发态。在这个阶段，STED灯和能量水平没有相互作用，明白吗? But what it does is essentially sets up a standing wave between two energy levels. Normally, one of the lower vibrational levels at the first excited state, and one of the higher vibrational levels of the ground state. So it's not absorbed by the molecule, it's not doing anything kind of in terms of energy change at this stage, but it's there in the background, it's set up a standing wave in the background.

我们的激发光被吸收，分子被激发，我们的振动弛豫是标准的。现在，这就是STED灯发挥作用的地方，一旦我们到了这个阶段。STED灯基本上是一个能量转换的催化剂。好吧?所以，通常情况下，如果STED光不在那里，荧光分子，分子会，随机地，回落到基态。它在一个相当随机的波长下这样做。你知道，这就是为什么我们有广谱，它可以发生在许多不同的波长，这是一个相当随机的过程。

当STED光出现的时候，它实际上是在催化分子，使其进入一个特定的能量转变。这个能量跃迁和STED光子的能量完全匹配。这个过程叫做受激发射。我们的激发态分子基本上和我们的STED光发生了共振?所以，STED光并没有被吸收，它一直呆在那里，它实际上从另一边出来，所以你得到了原来的甜甜圈光子。它基本上迫使分子回到基态以和STED光子相同的能量。

当然，这意味着能量仍然需要被释放出来。所以你从模拟任务中得到第二个光子看起来和最初的STED光子一样。所以，激发进入，它被吸收了。一旦光子进来，两个STED光子就出来了。所以你得到了原始光子，和一个通过迫使荧光分子沿着这个特定的跃迁而得到的光子。然后又是振动弛豫。

所以这里唯一的区别是，荧光显微镜可以发生在任何…荧光发生在任何旧波长。受激发射只发生在STED光束波长范围内。所以你可以很好地过滤掉它。所以你仍然可以得到光，但是你知道它确切的波长。所以，如果我们有一些光谱，你会在激发峰处有激发光，然后你会在发射光谱尾部的某个地方有STED光。

所以你的荧光会在C波长之间，然后你会过滤掉任何比STED光更红的波长，或者比STED光更红的波长，因为那基本上是这个甜甜圈从另一边回来。好的,很酷。

所以你唯一能检测到的荧光是中心的光没有经过这个STED过程，即受激发射。是什么决定了STED显微镜的分辨率?甜甜圈中间的洞有多大。所以，重要的是要知道在STED显微镜下产生甜甜圈的光学，它们仍然受到衍射的限制，明白吗?在做甜甜圈的过程中，衍射极限并没有被打破。

你要做的就是通过增加组成甜甜圈的激光的强度把中间的洞变小。这些环的大小都是一样的，只是我增加了强度。所以如果你想象一个高斯曲线或钟形曲线，如果你增加强度，你也增加了峰值，同时也增加了他的翅膀。这些翅膀基本上都在侵占甜甜圈的中心。所以我们得到越来越高的强度，这挤压小孔越来越小。你可以从这张纸上的小动画中看到，24纳米直径的荧光光束正在被成像。如果你没有开启STED，那么你的衍射就会变得模糊。

如果你增加STED光束的强度，你就能把甜甜圈洞变得越来越小，你就能提高分辨率，这样你就能看到所有这些单独的小光束，真的很酷。

所以STED的主要特点是，它是一种共聚焦技术，它有共聚焦显微镜的所有优点。光学切片，你可以得到非常高的时间分辨率如果你扫描一个非常小的区域。它应该适用于任何荧光团，只要你有合适的波长来激发和消耗。所有的荧光团都能经历STED，这就像一个基本的光物理过程，受刺激的发射。讽刺的是，这实际上是激光的作用。缩写LASER代表受激辐射的光放大。

所以任何东西都可以被激发发射，这不仅仅是荧光分子，只要你足够努力，任何东西都可以被激发发射。空间分辨率在技术上是无限的。所以，理论上，你可以让这个洞无限小通过让你的STED光束无限强。例如，它不需要像SIM那样进行任何计算后处理。所以，基本上，这是一种打开STED光束，得到你的图像，它已经有超分辨率了。

有几个商业实现。所以，徕卡制造了一个STED显微镜，伊比利亚仪器公司也做了各种各样的STED显微镜平台。事实上，很多STED显微镜都是在自制系统中完成的。伊比利亚的现在非常流行。但是家庭自制的STED已经获得了目前为止最好的分辨率。

让我们来看看STED显微镜的几个应用。bob综合app官网登录这是一个用STED显微镜发现结构的例子。这是果蝇神经肌肉连接处的两种结构蛋白的双色STED显微镜。在共聚焦的图像中，你可以看到我们的洋红色的蛋白质，这个果蝇的rim结合蛋白和这个绿色的Bruchpilot蛋白的一个大斑点在一起。如果我们观察STED，你实际上看到的是它在中心蛋白质周围形成了一个环。这可以用来制作神经肌肉连接处蛋白质分子结构的非常精细的三维模型，非常酷。

这是一个双色实时STED显微镜的例子。这是一个细胞生物学的应用。这是一种g蛋白它是如何参与高尔基小管的形成的。我们的高尔基体是绿色的，这个r型蛋白质是紫红色的。你可以看到高分辨率，这是每10秒拍摄的结构。

STED在神经科学领域也很受欢迎。当然，那是因为我们喜欢我们的，你知道，我们非常喜欢这些先进的共聚焦显微镜，我们可以深入到组织内部。这是一个活体STED显微镜的例子。这是在一只活的老鼠体内。这是树突棘的形态。所以，老鼠会在这些树突中表达某种荧光蛋白。在这里你可以看到非常快的分辨率，非常快的时间分辨率，非常高的空间分辨率来捕捉真实的动物树突脊柱形态的变化，非常酷。

STED显微镜的局限性，所以，正如你所能想象的，多色成像是相当困难的。记住，普通的共聚焦显微镜，每个荧光团只需要一个激发束。在STED显微镜中，每个荧光团都需要一个激发束和一个耗尽束，明白吗?你不希望发生的是，如果你不希望你的第一个荧光团的耗尽光束从样品中的另一个荧光团开始激发荧光。

虽然STED在技术上有无限分辨率，但这需要非常高的激光强度。所以，这只是一个小的例子，从论文中增加激光强度，在STED显微镜。这种不祥的黄色东西是什么，它表明样品已经破裂了，样品的内容物泄漏到外面，实际上对样品造成了物理损伤，因为你试图提高分辨率，在样品中沉积大量的能量。这可能有点棘手。

在我读博士的时候，我已经从光物理的角度做了一些STED显微镜，这是我所做的。其中一个荧光晶体，就是用STED成像的。所以在STED中，你会得到这些荧光晶体在一个漂亮的有结构的图像中。希望我的脸不会碍事。它在这个屏幕上，但在另一个屏幕上没有。不好意思，如果你看不清，我的脸下面有一块融化的水晶它真的爆炸了因为我对它进行了STED显微镜检查。

这就是第一个演讲的全部内容，希望是关于STED的。你应该能理解为什么一般情况下光束越小分辨率越高。STED如何结合光束整形和受激发射的光物理过程来提高分辨率，以及STED显微镜的优缺点。这在这篇论文中得到了很好的阐释。谢谢你们参加我的前半部分演讲。下节课我们会讲到单分子定位显微镜，以及超分辨率的未来发展方向。

10课成绩单

欢迎回来。这是我的第二堂超分辨率显微镜课，在这堂课中，…我们已经在第一讲讲过了…我们讲了衍射极限，SIM显微镜和STED显微镜在这次演讲中，我们会讲单分子定位显微镜和更先进的技术，这个领域的发展方向，技术的现状，最前沿的是什么。所以单分子定位显微镜，也叫SMLM。还有一些其他的首字母缩略词，我会在这里稍微解释一下。

首先，让我们想想，单个荧光分子的图像是什么样的?这是一个真实分子的真实图像。这是Alexa Fluor 647的一个分子的图像?一个我已经成像的分子。酷。无聊,但很酷。我想让你们看着这幅图我想让你们思考，我知道分子的中心在哪里吗我有多大把握知道分子的中心在哪里?所以如果我看着这个，我会想，“好吧，我很确定分子的中心在这附近的某个地方。”你知道，它不会在这里。它不会在这里。 It's not even going to be here really, maybe here, but most likely here.

所以我们已经可以从这个单分子的图像中推断出比实际图像中更高分辨率的信息。我们可以在心理上找到那个中心，比我们在图像上看到的更好，而且很多时候如果你能在心理上做某件事你就能通过计算来做。我能做的就是拟合二维高斯函数来精确地找到分子的中心。所以这是完全相同的信息强度在z轴上X Y在这里，这是适合分子强度的。根据这种适合度的参数，我可以说，“好，酷。中心就在那里。”我可以把它和原始图像联系起来找到中心。好的。

如果我们有一个单个分子的图像那么我们就可以很容易地从高斯拟合中准确地算出中心的位置，而高斯拟合的质量，我们对拟合的信心程度就和我们对中心位置的信心程度有关。你知道，这个，基本上代表了我们定位的错误。如果我们能将高斯函数与单个分子的图像拟合，我们就能得到中心以及中心所在位置的置信区间。就像这样。所以它可以把我们的原始数据转换成更高的分辨率。太好了。

现在如果你想一个广角荧光显微镜图像。例如，这是一些用Alexa Fluor 647标记的微管，同样的，和我们之前看到的一样的染料。所有这些图像都是很多很多的单分子图像叠加在一起的，对吧?所以有一张图像包含了非常复杂的空间信息。我们在单分子定位显微镜中所做的就是试图再次找到那些单分子。为了做到这一点，我们不是用一张所有分子同时发射荧光的图像，而是用大量的图像每帧都发射少量荧光小分子的图像。

所以我们从一张包含非常复杂的空间信息的图像到大量包含更简单空间信息的图像，你可以看到这看起来像……这被称为，眨眼，因为它看起来真的像眨眼。这个过程是这样的，我们会讲到我们是如何产生闪烁的，别担心，我们实际上是让荧光分子打开和关闭。如果我们观察这两张图像之间的差异，每一张闪烁的图像，我认为你甚至可以，你知道，如果你有纸和笔，就可以精确定位每一个分子的中心，开始建立我们数据的高分辨率图像。显然，我们不用纸和笔来做。

我们用高斯拟合的方法我们对整个图像进行高斯拟合找到单分子然后我们将其渲染成图像。这是随着发现越来越多的分子而形成的图像。酷。你可以看到这里的分辨率比之前高了很多。简单总结一下单分子定位显微镜，你把荧光及时分散开来，这样我们就能看到单分子，然后我们就能准确定位每一个单分子的中心，并建立一个它们在样本中位置的地图。太好了。

你们可以想象，整个技术中最重要的一点就是我们是如何实现眨眼的?你知道，如果我们到显微镜前把样品放在显微镜里我们就会得到一个长时间的序列，它不会神奇地开始闪烁。要做到这一点，你需要有一个荧光标记系统有开状态和关状态，明白吗?所以我们的启动状态是荧光和发光，我们可以看到它。我们的外状态是黑暗的，好吗?我们需要至少能够在这两者之间向一个方向过渡。这里是开关速率和开关速率。决定在荧光的开态和非荧光的关态之间移动的速度。很多单分子定位技术的区别在于如何产生闪烁。

其中一种叫做PALM，也就是光激活定位显微镜，在PALM中，你通过荧光蛋白来实现闪烁荧光蛋白有暗态和亮态或者某种开态和关态你可以在两者之间转换。另一种方法是STORM，随机光学重建显微镜，在这种情况下，你没有荧光蛋白有开态和关态。你有有机染料，比如Alexa Fluor染料，可以在关闭状态和打开状态之间切换。最后一种比较流行的实现闪烁的方法是DNA- paint，这是一种用于纳米级地形成像的点积累，在这种情况下，它使用DNA的融化使短标记的寡核苷酸离样本更近或更远，这就是你的开态和关态，从DNA分子到感兴趣的结构的距离。

所以我将逐一介绍它们，了解它们是什么样子的。那么如何在PALM中实现眨眼呢?这就是我们使用荧光蛋白的地方。第一种方法是使用光激活荧光蛋白，如光激活GFP。光激活型绿色荧光蛋白是一种破碎的绿色荧光蛋白。如果你用可光激活的GFP标记一个样本，你就会得到这种，在荧光团中间的，破碎的发色团，它是黑色的，对吧?所以如果我试着像正常的绿色荧光蛋白一样成像，它不会发出任何荧光。这是off-state。然而，如果我用一些紫外线，一些激活光照射GFP，也就是用一些激活光照射我的一些分子，它们会随机地进行氢键的重排来激活发色团?

所以如果我用紫外线激活一些绿色荧光蛋白分子就会变得活跃。所以它们会变成一种功能性的绿色荧光蛋白，然后被激发并发射荧光。太好了。然后过一段时间，它会回到暗状态或者开状态会被永久漂白，所以我们可以有这些开和关的过渡。所以你可以想象，如果你在成像，你有UV激活在一个水平上不断地使荧光团进入开态你的激发本质上得到荧光然后转换回关态。所以这是一种平衡的行为激活光和激发光以达到良好的眨眼速率这样就得到了单个的分子。

另一类用于PALM的荧光蛋白是可光转换的荧光蛋白，例如Dendra2。所以非状态的Dendra2是一种很糟糕的绿色荧光蛋白。所以如果Dendra2处于关闭状态你试着用490纳米的激发成像你会得到一些非常糟糕的荧光，低强度的荧光。但是当你激发这个脱离状态的Dendra2时发生的另一件事是，它会引起中间发色团结构的变化。在这种情况下，碳碳双键的形成。然后是Dendra2，用490纳米的光，可以把这个绿色的荧光团变成红色的荧光团?所以在这种情况下，如果我们也施加一些激发比如561纳米那么我们就会得到很多红色的荧光。

所以在PALM中，我们的眨眼是由激光强度和光激活蛋白UV和激发光的波长调节的平衡它们以获得正确的开-关比例光转换荧光蛋白会有我们的基本转换光使它同时进入红色状态与激发光同时产生我们实际检测到的荧光。这就是PALM的工作原理。

STORM略有不同。这是用类似的有机荧光团代替荧光蛋白。所以STORM中的启动状态基本上和我们在所有常规荧光显微镜中使用的状态是一样的我们有激发和发射，我们的目标只是在这个循环中循环很多次，产生大量的发射，成像我们的结构。这些并不是荧光分子的唯一状态。这只是单线态的一种表示。分子中还有一种状态叫做三元态，从技术上讲，因为根据力学，单线态和三元态之间的过渡是被禁止的。这是一个量子力学，就像被禁止的跃迁，但是，因为量子力学很古怪，你可以打破这个定律。如果你足够努力，你可以打破这种禁止的过渡。如果我们足够努力，这意味着什么?

假设我们确实增加了激发的强度。这对这个分子意味着什么?一旦它达到激发态，它就会发出荧光然后它会立即被驱动回到激发态。所以当我们大大提高激发强度时，分子在激发态的时间比在低强度下要长得多。如果你处于激发态，有一个很小但不可忽略的概率你会滑入三元态?所以你不能从基态到达那里。你只能从激发态到达那里。这是一个概率很低的过程你可以通过确保分子尽可能处于激发态来提高概率。

好，我们进入三元态。酷。所以这是随机发生的，概率很低，偶尔你会以分子的形式掉进去。如果你处于三重态，你就不能做荧光，所以你是黑暗的，明白吗?这很好，对吧?我们得到了少量的开态分子最终得到了相当大的脱态分子分子，因为，我们不能在三元态中进行荧光，而三元态的寿命比单线态长得多。所以一旦它进入三元态，即使发生这种情况的概率很低，它会保持很长时间，对吧?这可能要几秒钟，你知道的。一个荧光周期需要几毫秒。三重态的生存期可以超过秒。 So that's how the blinking is generated in STORM. We knock our molecules into triplet state and from here they can undergo some more transitions. So within the triplet state, they can then go to a radical state and from that radical state, they can actually undergo permanent bleaching. You've broken your molecule.

或者，你可以尝试让分子回到单态这是通过化学介导的转变，所以通常有缓冲作用。所以，你也可以通过紫外线调节，从三重态过渡到单线态。所以，从技术上讲，单线态和三线态之间的过渡是被禁止的但你可以设计一些条件让它们比你预期的更有可能发生?所以STORM中的眨眼是由几个因素调节的。首先，激励强度。这就是把物质推到关闭状态的东西，我们的三联态，我们的缓冲，这是一种化学介导的转变可以把物质从关闭状态带回打开状态，所以荧光，以及任何你放在样品上的紫外线因为它也可以帮助从关闭状态恢复到打开状态。所以，如果你有正确的激发强度组合，正确的缓冲条件，和紫外线光照，那么你实际上可以很好地微调分子的闪烁统计。

好的。最后一种产生眨眼的方法是喷漆，dna喷漆。所以DNA-PAINT…这是离态。所以我们不用标记我们想要成像的目标分子用一种主抗体比方说，用荧光染料偶联它或者它与荧光蛋白融合，我们用抗体标记但不是荧光团，而是用一种叫做对接链的DNA短链，对吧?所以这是一条单链DNA。这就是我们给样品贴上标签的方法你可以看到，样品上没有标签。然后将DNA链放入样品成像仪中。这是对接DNA链的互补序列上面有一个荧光团。这个想法是，你可以设计这些DNA链，让它们随机结合和不结合，从而真正利用DNA的融化来实现这一点，让荧光分子离目标更近，然后离目标更远。

假设它是随机发生的，对吧?每隔一段时间，你的DNA链会扩散过去它会结合到你的对接链上然后那是你的状态发射荧光过一段时间，因为那个序列和DNA链的碱基含量会融化并扩散出去你就会得到这个断断续续的成像仪DNA链，在你的成像溶液中，你把它与你感兴趣的目标结合和分离。所以决定眨眼概率的因素，在这种情况下，决定眨眼速率的因素是DNA链的序列和成像仪链的浓度。所以更高的频率放入越来越多的成像仪链，它就越有可能足够接近你的目标链从而结合并眨眼，基本上。

但基本上，如果你有了算法，你就不关心它是如何生成的了?所以如果你有这个过程的一部分，如果你……你知道，寻找单分子的计算过程，通常你并不知道它是如何产生的。所以关键是，不管你是怎么眨眼的，在一天结束的时候，它看起来总是非常相似的。在你的样品中，它看起来总是像短暂的闪光。所以不管你给样本贴上什么标签，它通常都是用完全相同的方法分析的。唯一真正起作用的是你眨眼的密度。所以如果有很多分子重叠，更接近中心区域，情况就会不同。所以，如果你的算法不能准确地分辨出一个或两个重叠的分子，你就会出现问题，但理想情况下，你会有很好的，稀疏的闪烁，很容易看到单个荧光分子闪烁，无论你产生什么。

单分子定位显微镜的主要特点是，它是一种广角显微镜技术光学非常简单。所以对于SIM，我们需要放入某种光栅或模式发生器来产生高频模式然后进行线路干扰。相反，你需要放入第二束光学激光来制作那个甜甜圈。在单分子定位显微镜中，你只需要一个带高强度激光的广角显微镜，这样我们就可以使用STORM和PALM，并确保我们能正确地调节这些过渡。单分子定位显微镜的空间分辨率在技术上也是无限的。限制你分辨率的唯一因素是你对单个分子的适应程度。再次强调，你有无限明亮的闪烁你可以非常非常非常精确地匹配，你会有无限高的分辨率。

那么单分子定位显微镜有哪些应用呢?bob综合app官网登录这是用单分子定位显微镜发现的最酷的东西之一这是神经元的细胞骨架亚结构，同样，这可以在三维空间中完成。我不会讨论如何在单分子定位显微镜中成像三维图像，但这是可以做到的，如果你想了解更多我会提供一些复习。但这是三维单分子定位显微镜，在这里是STORM。

我们看到的是，如果你对不同的细胞骨架成分如肌动蛋白，蛋白和内收蛋白进行STORM，你看到的是沿着轴突以这种非常周期的方式，沿着轴突非常漂亮的条纹图案，观察不同的蛋白质，你会看到它们实际上，以这种非常规则的，可重复的间隔插入，沿着轴突形成的图案。根据这个，他们可以做出一个模型来展示细胞骨架在轴突内是如何组织的。每一个这样的肌动蛋白环的间距大约是190纳米，所以它们不能用传统的显微镜观察到，我认为这是一个非常重要的作用在区分像钠通道到轴突特定区域的东西。这真的很酷。在我看来，这是最漂亮的超分辨率研究之一。这是一个真正的结构发现。

最近，这是STORM被用于病毒学结构发现的一个例子。这是牛痘病毒。这是一个非常非常大的病毒。它的大小大约是300纳米，但是在分辨率的背景下，这是有问题的，对吧?我们在这里看到的是如此的不同……当你用Alexa 647或STORM染料标记痘苗中的不同膜蛋白并成像时，你实际上可以看到在病毒本身的膜中有不同蛋白质的某种组织。举个例子，这些蛋白质在膜的顶端极化，这在它与宿主细胞融合的能力中起着非常重要的作用。这有点疯狂，病毒膜上的结构发现一直是STORM的用途之一。

你可以用活细胞单分子定位显微镜，但这并不容易。这是一个使用活细胞PALM的局部粘连的例子。所以如果你在做活细胞的超级分辨率你几乎总是会使用PALM因为荧光蛋白，除非你在细胞表面做一些事情你可以使用某种表面受体抗体等。但在这里你可以看到这些局部粘连当细胞在使用活细胞的PALM移动时。

那么单分子定位显微镜的局限性是什么呢?好吧，最重要的是你需要把你的样品准备好。你需要做非常专门的荧光标记。你需要确保你的缓冲是正确的。如果你用了错误的标签，它就根本不起作用。有些荧光蛋白很难让它们眨眼。此外，你使用的缓冲和你需要调节开关事件的激光功率通常是完全不友好的活细胞，缓冲通常是氧化还原缓冲所以它们控制氧化状态。细胞并不喜欢它们。激光的力量会很快变得非常非常强烈。你还需要很长的获取时间，对吧?

所以如果你想要漂亮的…你需要做的是，如果每帧只有很少的荧光分子发出荧光，你就会有很多帧，对吧?你要确保你捕获了样本中的每个分子至少一次。如果没有足够的坐标系，就会得到不完整的结构。你不可能捕捉到每一个分子的闪烁所以你需要非常低的采集时间，这对活细胞成像是不利的，当然，如果你已经使用了相当高的激光强度，但这对动态结构也有一些问题。假设你有一个移动的样本，你知道，你的荧光团位置，在你能捕捉到它之前，有点移动了。

这里有一个例子。这是和上一张幻灯片相同的数据集它显示的是取决于你花了多长时间。分配给一个PALM图像多少时间就能改变它的样子。这是30秒成像后形成的病灶粘连。这是一帧180秒的图像。所以这不是一个时间序列，这只是通过一个帧，或270秒的成像。它们以三种不同的颜色叠加在一起，青色，黄色，品红，你可以看到你的结构将会不同取决于你获得多少帧来创建一个单一的超分辨率帧，对吧?

最后，当你试图定位分子时，你会得到很糟糕的假象。再一次，我简单地提到过，例如，如果你的眨眼很密集，如果你不是很稀疏，如果你偶尔有重叠的荧光团这可能会让重建变得有点混乱。很多时候，算法并不知道如何处理这些重叠的分子。假设这里有一个分子，这里有一个分子，很容易定位，这是两个独立的物体。如果它们重叠，那么算法通常认为它是一个大的脂肪分子，所以你实际上丢失了信息，这里有一个例子。

这是一个很好的微管的单分子重建。你可以看到清晰的细丝。在右边，是相同的数据集，但分析方式不同，分析方法是如果分子重叠，就会出现问题，你可以看到这种模糊和结构的合并。你会得到不完整的结构，等等。所以在单分子定位显微镜中你会得到一些非常糟糕的伪影。

就制造商而言，所有主要的…所有主要的?尼康绝对是单分子定位显微镜。蔡司。有一家叫做牛津纳米成像的公司它喜欢很多台式单分子定位显微镜，在这种情况下很容易找到因为你不需要任何额外的光学设备。你只需要强大的激光。这就是单分子定位显微镜。

希望在那之后，你们现在能理解为什么我们可以准确地确定单个发光荧光团的中心。你知道，它们每次看起来都是一样的所以你可以准确地计算出中心的位置，如何以不同的方式产生闪烁，以及单分子定位显微镜的各种优点和缺点。这是我用得最多的一个所以这里有一个很好的回顾但也有一些幻灯片和一些演示我为其他讲座做的分析，如果你想进一步了解这个可能会有用。

这就是主要的超分辨率技术。我希望你们能。希望你们能从这两个讲座中，意识到没有一个是最好的技术，对吧?它们都有优点和缺点，例如，单分子定位显微镜具有可靠的最高分辨率但它可能最有可能杀死你的样本。另一方面，SIM，你知道，它没有很好的空间分辨率但它实际上是很直接的。所以你真正想从样本中得到什么?你想看什么样的信息?大量的时间衍射限制是一个很好的方法。

现在我开始了这些演讲，说超分辨率很好，它填补了荧光和电子显微镜在分辨率上的差距，但所有这些方法都有很大的缺点。所以如果你想让显微镜在衍射受限的情况下工作不要达到超分辨率，明白吗?只有当你优化了衍射有限的系统，并将其推到你所能承受的极限时，才能真正实现超分辨率。如果你要…永远不要直接用超分辨率来解决成像问题，因为你会给自己带来比你解决的更多的问题。

这里有两个很好的资源，比较不同的超分辨率方法，以及何时使用它们。在《自然细胞生物学》上有一篇评论，有一张非常漂亮的海报，画出了它的优点和缺点，并向你展示了例子数据集。

好的。那么现在在超分辨率显微镜中发生了什么呢?你有SIM, STED，和单分子定位显微镜，它们都很成熟。它们都被使用了很长时间。每个人都很熟悉它们。让我们回想一下上次谈话的开头。我们为什么不做电子显微镜呢?它的分辨率非常非常高。答案是超级分辨率应该适用于活细胞，对吧?你知道，否则我们还不如做电子显微镜。 So what I'm going to show you here is this is a fluorescent and transmitted light image of some cells that are expressing tubulin and GFP. You've got two interface cells that are nicely spread and two mitotic cells which are rounded up, and I've got the intensity of the laser illumination up the corner here.

现在，在这部影片中，我要做的是，我要增加激光照明的强度。我要看看会发生什么。所以增加强度，不好的事情很快就会发生。你可以在这些有丝分裂细胞上看到很严重的气泡。你可以看到这些界面细胞的收缩，你知道，当我们增加强度时，事情对我们的活细胞变得非常非常糟糕。这种情况开始发生的强度，我们细胞中开始发生坏事的强度比你想象的要低。即使像SIM这样的技术被吹捧成，你知道…尤其是SIM卡。人们说，“哦，它很轻，对活细胞非常友好。”它实际上已经进入了你开始看到这些不好的，光毒性产物的状态。再一次，这是你使用SIM的地方，那是你的细胞开始显示出极度痛苦的迹象。 And this last frame here would be a typical STORM imaging intensity and you can see you just don't wanna be doing that with live cells, okay?

你知道，这些细胞不快乐的原因是光毒性，所以有很多原因可以导致光对细胞具有光毒性。如果你用的是紫外线照明，记住我们说的是单分子定位显微镜，你实际上可以，你知道。我们需要它来促进一些眨眼的转换。实际上可以诱导UV反应的凋亡。你可以直接破坏DNA链，但光毒性和超分辨率显微镜最常见的原因，一般来说，是你可以产生活性氧，这只是激发大量荧光的副产物来自你试图成像的物体和样本中的其他荧光团和分子。

当你使用高强度的照明时，你会产生活性氧，然后聚集在细胞周围氧化所有东西，让你的细胞非常不快乐。好的。所以氧化细胞是一个问题，对吧?我们想要做活细胞的超分辨率显微镜，因为，你知道，如果我们不关心分辨率，我们会使用普通的荧光。如果我们不关心细胞是否存活，我们就会使用电子显微镜。

所以我们可以使用各种策略来解决光毒性和超分辨率显微镜。显然，你可以试着减少样品的光线。这是三个成像系统的例子。宽视场，我们照亮所有的东西，共聚焦，你照亮在一束细光内的所有东西，双光子，你只激发焦平面上的分子。你可以使用非均匀照明来尝试减少样品的光剂量，例如，多焦点照明，或以某种时间块的方式传输光。我们还可以做空间自适应照明，这取决于样本中的荧光是什么，你可以让你的，你知道，光更强或更弱，所以只在需要的地方提供光来激发分子，例如。

你也可以使用光板照明系统。比如高斯光片，你只照亮你成像的分子。所以，如果你平行于成像平面照射，那么你就能得到很好的平面光，你可以直接收集，或者晶格光片显微镜，你实际上可以照射一个非常薄的光平面，所以你甚至不用考虑到照亮和激发焦平面上下的分子的问题。

所以我们可以考虑空间适应性技术，这是在STED显微镜中已经做了很多的事情。bob平台下载手机版例如，牛津仪器公司现在已经有了可以做到这一点的商业系统。比如说你有拯救STED这样的项目，你只是。在这种情况下，你用你的共聚焦光斑扫描，你的激发激光，只有当有荧光时你才打开你的STED光束。所以你并不想把STED光束送到没有荧光分子的样品中。你只需要在样品中有分子的地方放上STED光束就可以了。好的。这很酷，用激发激光扫描。有荧光，把STED打开。扫描，哦，没有荧光，把STED关掉。这就减少了进入样品的STED光的数量。

还有一种类似的技术是DyMin，这实际上是在调节测试光束的功率，测试光束的强度直到你达到某种分辨率阈值，例如，因为记住，假设我们正在扫描，我们会说，“好吧。我们发现了一种分子，但我们想尝试将分辨率提高这么多。”我们已经做到了。让我们继续。所以增加测试光束的功率，直到你得到足够的能量，因为分辨率与光束强度成正比。

晶格光片显微镜是一种非常酷的技术。这就是晶格光片显微镜的样子。它看起来不像显微镜它可以让你用非常薄的光照射样品就像这里展示的那样然后检测垂直。这基本上可以与其他广域技术相结合。所以你可以把每一片光看作是SIM或单分子定位显微镜的潜在成像平面。这很酷。更少的光没有穿过整个样品但是在这些薄片中仍然有超高的分辨率。这是晶格光片SIM的一个例子。这是活的海拉细胞中的肌动蛋白。所以你可以看到非常非常高的时间分辨率，以及非常好的空间分辨率。

在右边，我们将看到一个使用晶格光片显微镜的例子。在这种情况下，它是Dendra2，我们之前说过的光可转换荧光蛋白，它从绿色到红色结合到核层膜上的层蛋白A上，你可以看到建立这张非常漂亮的核层膜的高分辨率图像。同样，你可以在三维空间中做当你把光片穿过样品时，你会得到这个绝对令人难以置信的漂亮的三维分辨率。我只是想说，我看了一段时间，因为我认为这绝对是华丽的。再一次，我们通过核回到不同的切片相比，衍射受限的右边。好的。晶格光片显微镜非常酷。它向样品输送的光更少因为你并没有照射到大块的样品，而是照射到小薄片，你可以在样品的单薄片上进行超分辨率成像。

SIM在硬件方面也有很多其他的发展，这只是一个例子因为我认为它的数据非常漂亮。这是一种叫做掠入射SIM的技术，同样是普通的SIM，你把你的光片放入你的样品中但你仍然会得到失焦的荧光，你会再次得到，光损伤，整个光柱当你的光束穿过你的样品时。放牧入射SIM，再次允许你限制你的SIM成像到焦平面周围的一个薄平面。再一次，你可以用非常漂亮的，非常快的双分辨率多色SIM成像，这对于这种模式来说是绝对美丽的。再说一次，非常可爱的细胞动力学。同样，这也得益于这样一个事实你不会对样本造成太大的破坏因为你没有把光输入到样本的整个厚度中。你只是把它限制在一小条上。

一件非常有趣的事情是像素重新分配方法的出现，比如Airyscan和iSIM，人们经常会说像素重新分配方法不是超级分辨率的方法因为你并没有真正获得分辨率的巨大提高。你可能会得到1.4倍的分辨率与分辨率相比，分辨率是2倍，然后用STED和单分子定位显微镜得到更高的分辨率。然而，这些东西现在真的很受欢迎，因为它们没有光毒性，也不会损坏照片。它们也很容易使用，所以如果你在考虑用什么超分辨率技术来进行成像，这些通常是一个很好的开始，因为它们可以开始告诉你，少量的分辨率提高可以为你的成像做什么。这可能就足够了，而且它不会像其他一些技术那样使你的生活复杂化。这里有一个例子。我想这是iSIM，你可以看到你在这张图片中得到了非常漂亮的动态，这里有一个，非常可爱的回顾关于SIM的当前和未来的发展特别是包括了很多像素重分配方法。再放一遍电影。

最后，在超分辨率显微镜中解决光毒性的另一种方法…你知道，我给你看过所有这些漂亮的东西。自适应照明。有光片照明来减少进入样品的光剂量。但如果我们把激光强度调低呢?最坏的情况是什么?这是Alexa Fluor 647的一个例子。这是一些真实的数据，有一些闪烁的数据其中入射照明强度大约是2千瓦每平方厘米。作为一种比较，一种基准，太阳照射地球的亮度…太阳在地球表面的照度大约是每平方厘米0.1瓦，所以这是一个高强度的情况。如果我把激光强度调低，同样的例子，同样的成像，这个数据集会是什么样子?

这是数据集的超分辨率渲染。它看起来是这样的。这是40毫瓦/平方厘米，正如你所料，它看起来有点像常规的荧光成像。你根本看不到它在眨眼。如果我尝试做一些很愚蠢的事情把这个数据集通过我的单分子定位算法，试图找到单个分子，那么，当然，我们会得到一个糟糕的图像。它在数据集中找不到任何看起来像单分子的东西。所以你可以做的一件事是，有一系列的计算技术，实际上试图从低强度的数据中获得计算的超级分辨率。

其中一个是在我现在的实验室里卡多·恩里克实验室开发的，叫做SRRF，它是一种超分辨率无线电波动，这是一种试图找到荧光分子的方法，而不使用这种，二进制…这个分子是吗?这个分子是no吗?这些概率表示图像中最可能存在分子的位置?对于这张图像，你可以看到我们实际上得到了高分辨率的图像没有标准单分子定位重建中所有缺失的信息。

例如，SRRF的优点之一是它可以与任何荧光团或任何显微镜一起使用。这是一个共聚焦显微镜下的营养蛋白GFP图像。SRRF通常每张SRRF图像使用10到100帧，因此它分析一系列图像中的荧光，用单分子定位算法所做的相同的方法将其压缩到一张图像中，但不试图找到单分子。再一次，你可以看到这是活细胞的数据细胞在那里很快乐我们有很好的时间分辨率。再一次，波动越多，强度变化越多，闪烁次数越多，像SRRF这样的东西分辨率就越高，但作为起点，这是一个很好的起点。你不会得到最高的分辨率，但你会开始看到你可以在不需要购买新的显微镜或不需要做一些非常花哨的样品制备的情况下实现的潜力。

为了完成软件开发在超分辨率的前沿，有一件事，有点，出现在前面的是基于深度学习的方法。所以它们使用了，神经网络和强大的，人工智能风格的计算，从可能不合格的数据集推断出超分辨率。这是一个基于神经网络的技术的例子它使用神经网络来重建SIM数据。这是用标准SIM重构重构的数据同样的数据也经过scU-Net重构。看起来不错。看来你的分辨率高多了。

还有另一种…再说一次，这是一个非常非常有发展潜力的领域。但另一个例子是ANNA-PALM，它学习了如何用比通常的单分子重建少得多的帧来做出好的超分辨率重建。这是一个广角图像的例子。如果您使用300帧来制作您的PALM图像，那么它将看起来像这样。如果您使用30000帧来制作您的PALM图像，它将看起来像这样。ANNA-PALM最酷的地方在于它学会了如何从只有300帧的数据中获取30000帧的图像。这很酷。对任何深度学习都有一个警告你永远不知道它在做什么，好吗?所以你可能会在不知情的情况下得到藏物。 Artifacts in super resolution microscopy, in general, they're present but you normally know why they're there. In deep learning, you're never really sure they're there or where they came from, so that's just a word of warning.

好的。所以希望在课程结束的时候，你们现在已经熟悉了光是如何对活细胞造成损伤的，以及我们如何在超分辨率成像中使用硬件最小化光毒性。因此，改变我们向样本传送光线的方式，以及我们如何使用软件来处理不太好的数据，并试图从这些数据中获得更高的分辨率。我们最近做了一篇关于超分辨率显微镜下的光毒性的综述，这篇综述对所有这些都有更详细的介绍。

总结一下，这是你应该时刻记住的如果你在做任何显微镜工作不仅仅是拍摄图像包括任何处理或任何超分辨率。那么，你如何评估你的超分辨率数据，它实际上告诉你什么?例如，在超分辨率图像中，强度意味着什么?你的图像的分辨率是多少?你如何测量它?然后你怎么知道你的图像中是否有人工制品?所以在推断基于强度的信息时要非常非常非常小心，比如蛋白质计数，或者从超分辨率图像中进行任何绝对强度量化。

相反，SIM的强度应该代表分子的真实数量，但单分子定位显微镜的强度可能真的会误导。举个例子，假设我们有两个分子要成像，我们成像的方式，纯属偶然，左边分子闪烁的次数是右边分子的三倍。如果你不正确分析数据如果你不理解单分子定位显微镜图像的强度意味着什么那么你可能会得到这样一张图像你会说，“哦，蛋白质更多或者左边的荧光团比右边的多。”而在现实中，这个分子只是比右边的分子眨眼次数多。这是你需要记住的，当你在看超分辨率数据时，这是非常重要的。想想，作者说这告诉了我们什么这真的是信息告诉我们的吗?

再说一次，超分辨率显微镜的最大目标是尽可能提高分辨率，但要注意高分辨率并不一定等于高质量。这是一对相同结构的常规和超分辨率图像。几年前我做了一些软件。我还在开发第二个版本，但叫做SQUIRREL。这是一种量化超分辨率显微镜中的误差的方法，在这种情况下，它会给你一个误差图，说明在哪里超分辨率的图像比衍射受限的图像表现得更好。你可以用不同的方法量化分辨率。一种流行的方法，也是在SQUIRREL内部，就是傅里叶环相关，但也有一些更新的技术，比如图像去相关显微镜。

但是你也可以在SQUIRREL中做，例如，测量图像不同部分的分辨率，它会给你一个像这样的地图。SQUIRREL是一种软件工具，可以用来评估图像的分辨率和质量。很酷,很好。我希望这是有用的东西，因为这是我自己研究的一个不要脸的宣传，但是要小心，在你的头脑中，把高分辨率等同于高质量。在某些情况下，高分辨率成像就是高质量成像。我们看一下这个黄色的环。我们有非常好的高分辨率成像。这是广域等效的，误差图并不是说有什么特别的错误。但是如果我们看这个灰色的环，你知道，这是一个相当好的分辨率，66纳米。这和我们这部分图像的分辨率非常相似，但实际上，它的强度和我们的广域图像相比已经非常疯狂了这在误差图中显示出来。

所以，这更像是一种对数据持批判态度的教训。如果你在看一篇超级分辨率的论文，他们说，“哦，我们得到了30纳米的分辨率，”你知道，他们是如何测量这个分辨率的?这个决议告诉你什么?最重要的是，高分辨率并不意味着高质量。它可以这样做，但这并不一定是一回事。好了，在这一点上，我要提醒大家，非常感谢大家来听这些研讨会。我希望它们是有趣的，有信息的，如果不是，我希望至少有一些参考资料，你可以找到更多的信息，关于我们讨论过的各种东西祝你显微镜之旅好运。