Wohland实验室和FCS成像

在单个分子水平上研究细胞

超分辨率显微术通过揭示之前隐藏在衍射极限下的结构信息和相互作用，帮助我们对细胞生物学的基础知识有了更深入的了解。荧光相关光谱法是另一个强大的技术，已被用于确定时间动态的细胞过程与单分子敏感性。这两种技术用于提供关于细胞物理化学特性的丰富信息，但通常需要相互排斥的实验策略，以牺牲另一方的代价来优化空间或时间分辨率。通过在同一实验中同时捕捉空间信息和时间动态，可能会提高对复杂细胞过程的理解。如何将这些技术成功地结合到一个综合的方法中，是新加坡国立大学CBIS的Thorsten Wohland教授和他的同事一直致力于实现的目标。这些努力的结果已在他们最近在自然通讯”同时时空超分辨率和多参数荧光显微镜(Sankaran等人，2021年)。

结合时空超分辨率和多参数荧光显微技术

从单个图像堆栈中获取多个参数的基础是:FCS自相关的迁移率，FCS扩散定律的膜组织，数量和亮度(N&B)分析的寡聚化，以及来自超分辨率径向波动(SRRF)的超分辨结构——是一种后处理策略，其中原始获取的数据以一种适合于四种不同的结构和动力学报告技术的方式被重新利用。通过使用图形处理单元(gpu)进行计算，多参数后处理分析成为可能，因为这导致处理时间至少提高了10倍。

通过采用这种重新定位的策略，Wohland实验室研究了两种不同生物分子的结构和动力学:Lifeact——一种肌动蛋白结合多肽，以及表皮生长因子受体(EGFR)——一种参与细胞信号传递并涉及多种癌症的蛋白质。FCS中Lifeact的扩散信息可以去除Lifeact SRRF图像中的结构伪影。以EGFR为例，多参数研究显示，EGFR的定位主要由EGFR间和EGFR-细胞膜相互作用决定，而独立于EGFR-肌动蛋白相互作用。

利用每一组原始数据来获取多个生物物理参数提供了许多独特的优势。首先，这导致需要准备的样品数量和实验室中需要的实验数量减少，从而消除了多个实验中样品可变性的影响。其次，在同一样本中同时获取高分辨率时空信息，使得获取胞体结构和动态特性之间的相关信息成为可能。

什么显微镜系统被用于联合超分辨率和FCS?

在FCS和许多超分辨率显微镜中，精确测量荧光强度需要高灵敏度的探测器。多年来，这是EMCCD相机，比如Andor iXon EMCCD系列．除了高灵敏度外，与一般成像实验中常见的sCMOS相机相比，这些传感器具有一致的行为。近年来，市场上出现了新的背光sCMOS传感器，与以前的sCMOS型号相比，其灵敏度得到了进一步提高(尽管在低光水平下仍未达到emccd的水平)，并且在传感器均匀性方面也有一些改进。Wohland实验室使用了iconson EMCCD相机和Sona-11背景sCMOS进行FCS研究。Sona相机提供了一个非常大的传感器尺寸高达32mm对角线，而iXon EMCCD相机提供了优越的灵敏度在较小的视野。虽然没有一款相机能完美地适合所有的实验，但这允许选择适合实验具体需要的相机。

托斯滕·沃兰德教授就这个问题做了一个网络研讨会。你可以查看在这里．

FCS成像方便了所有TIRF和LSM用户

沃兰德研究小组的目标是让更广泛的科学界更容易获得FCS。他们这样做的方法之一是开发易于使用的数据分析工具，如ImageJ/Fiji的Imaging FCS插件。作为一名实验者，你有多少次通过数据分析发现测量不起作用?不仅仅是一个数据分析工具，斐济插件作为一种图像采集和校准软件，允许在测量期间显示实时相关功能，因此在实验期间提供即时反馈给实验者，而不需要专门的硬件，因为所有传入的数据都用CPU/GPU实时处理。来自所有像素的相关信息为探测样本上的复杂动态提供了另一个维度，否则仅看强度视频是不可能判断的。

这种实时方法改进了数据采集工作流程，提高了生产率和可重复性。鉴于目前最先进的仪器和在单分子水平上观察生物物理参数的任务的能力，光学对准是获得最准确和精确信息的主要瓶颈也就不足为奇了。通过优化每个像素的相关函数，可以在几分钟内实现全内反射(TIRF)和光板显微镜(LSM)的临界角度和聚焦的实时对准工具的开发，解决了这一问题。在多色图像分配器实验中，它允许对不同波长通道的像素进行对齐。需要注意的是，加上特定的显微镜控制，这些实现可以很容易地将荧光波动带入自动在线反馈显微镜领域。该软件支持一些最流行的EMCCD和sCMOS包括安多尔iXon (860,897, 888)和Sona系列(11和6.5)．

更多关于Wohland实验室的信息

你可以找到更多关于Wohland实验室研究和FCS插头在这里．

选定的出版物

1. Sankaran, J。et al。同时时空超分辨率和多参数荧光显微镜。Commun。121 - 14(2021)。
2. 长酰基神经酰胺控制细胞膜外叶动力学的胆固醇和细胞骨架依赖性。Biophys。学报- Biomembr。1862183153(2020)。
3. Macháň， R.， Foo, Y. H. & Wohland, T.关于FCS和FRAP的等效性:同时测定脂膜。J。111, 152 - 161(2016)。
4. 表皮生长因子受体在静息态和配体结合态下的质膜组织。J。109, 1925 - 1936(2015)。
5. Krieger, j·W。et al。在活细胞和生物体中成像荧光(交叉)相关光谱。Protoc。10, 1948 - 1974(2015)。
6. 成像荧光起伏光谱:定量生物成像的新工具。启。化学。65, 225 - 248(2014)。
7. 赵志刚，王志刚，王志刚，等。基于相机的荧光相关光谱学测量的精度和精密度。化学。85, 3948 - 3954(2013)。
8. 辛格,a P。et al。基于光片的荧光相关光谱二维阵列探测器的性能。表达218652(2013)。
9. 徐志强，王志强，王志强，等。基于ImFCS的FCS图像数据分析与可视化软件。表达1825468(2010)。
10. 郭丽萍，张晓东，张晓东，等。荧光相互关光谱技术在生物膜组织中的应用。J。97, 2630 - 2639(2009)。