病毒检测用病毒生物传感器的研制

最近，随着SARS、中东呼吸综合征和Covid-19等大流行，用于检测病毒病原体的生物传感器引起了人们的广泛关注。迅速查明受污染的食物或水、表面或病人样本中是否存在病毒，是有效抗击病毒暴发、流行病和生物恐怖主义的先决条件。

目前，依靠聚合酶链反应(PCR)进行病毒DNA和RNA的增殖和检测的试验实现了对病毒检测的最高灵敏度。然而，这种技术也有一些缺点。它的处理时间长(通常为24小时)，缺乏实时监测和快速现场病原体检测，而且需要这种先进的实验室设备和训练有素的人员。

人类诺如病毒生物分析检测方法(NoV)

瑞典查尔默斯理工大学一个由Fredrik Höök领导的研究小组开发了一种bio-analytical化验用于单个病毒敏感的全病毒颗粒检测。在他们最近的工作中，他们的重点是人类的检测诺瓦克病毒(11月)；一种传染性极强的病毒，可引起肠胃炎或俗称的“冬季呕吐虫”。

本研究以最常见的诺如病毒II.4基因组(Ast/6139/01株)的病毒样颗粒(VLPs)作为病原体模型。诺如病毒是杯状病毒科的一种小型非包膜RNA病毒，具有高度的遗传多样性。它由一个主要由保护病毒基因组的180个衣壳蛋白组成的二十面体外壳组成。

“冬天呕吐错误”

由这种病毒引起的“冬季呕吐病”通过大流行在全球传播。尽管它没有像中东呼吸综合征(MERS)或非典(SARS)等其他流行病那样引起人们的注意，但在发展中国家，每年有20多万人死于疟疾，其中主要是儿童。诺瓦克病毒非常稳定，传染性极强，通过口粪途径传播，经常在食用受污染的食物或水后自发爆发。它的监测是最重要的，因为极低的颗粒数(<100)可能就足以导致疾病暴发，因此对其早期检测具有挑战性。

在昆虫细胞中重组表达的自组装衣壳蛋白常被用来探测病毒的结合行为。这些非传染性病毒样蛋白(VLPs)表现出与真实病毒相似的形态和结合特性，并以高度特异性识别各种唾液和细胞表面糖缀合物，包括膜结合的组织血型活性糖缀合脂(GSL)。这些VLPs代表了设计用于病毒检测的新生物传感器原理的优秀模型。

图1所示。三明治试验设置的示意图表示。这些颗粒被捕获到含有10% H型鞘糖脂(GSL)的双分子层上，以高特异性识别VLPs。在含有5% H型1GSL的传感器结合罗丹明标记的囊泡的TIRF光照下产生荧光信号。

本研究中探索的分析基于三明治型结构，其中VLPs首先被捕获到含有NoV特异性gsl配体的非污垢(低非特异性蛋白质吸附)支持的脂质双分子层上。然后，通过对含有相同的11特异性配体的单个荧光标记的磷脂囊泡成像，可以看到牢固结合的VLPs(图1)。利用TIRF照明产生的消退场，区分表面结合的囊泡和溶液中的囊泡，可以确定和跟踪囊泡在传感器界面的结合和释放事件。因此，这种设置不仅可以可视化单个病毒颗粒，还可以获得它们与受体(在本例中是GSLs)亲和力的信息。［1］

使用TIRF显微镜结合iXon EMCCD相机以每秒5帧的速度获取包含1000帧的延时电影。该分析在96孔板中进行，所有感兴趣的孔在7个不同的位置成像，以确保重复性统计。使用基于matlab的软件对图像进行分析。简单地说，如果荧光囊泡的强度超过了预先设定的阈值，并且在预先设定的连续帧数(最少7帧)中出现，则对其进行计数。通过记录一段时间内新到达的囊泡数量生成关联图，并测量囊泡的停留时间。测定了该方法的检出限。

本研究结果表明，Höök博士和他的同事开发的用于检测诺如病毒的生物传感器具有良好的特异性，非特异性结合很少(图2)。该方法具有单分子敏感性，单个囊泡可以很容易地看到。小泡产生的局部信号可以很容易地从背景噪声中分辨出来。在有效抑制背景噪声的同时，影响检测极限(LOD)的一个关键因素是由非特异性结合事件产生的背景信号。需要考虑的一个重要方面是传感界面的非污垢特性，应该是病毒和囊泡驱避。本研究中使用的脂质双分子层满足了这些条件。此外，作者展示了如何利用囊泡结合事件的实时监测，根据囊泡在底物上的停留时间来区分特异性与非特异性结合，从而进一步降低非特异性背景信号。

图2。在12.5 pM VLPs孵育的双分子层表面结合囊泡的代表性显微镜图像(左图)和在没有VLPs的情况下的阴性对照(右图)。

课题组已经证明了一种相对简单的检测方法，结合单分子敏感性和平衡波动分析，可以用于检测LOD为~106个颗粒/ml的病毒颗粒。这LOD比迄今为止报道的上下文中被别人生物传感器的检测诺瓦克病毒,此外整个试验可以在不到两个小时中当前的一个重大进步最敏感的病毒检测,采用PCR方法。此外，这些技术可以推广到其他病毒病原体的研究。

[1] Bally, M.， Gunnarsson, A.;Svensson l;拉森,g . Zhdanov;副总裁;Höök, F.，单个病毒样颗粒与含鞘糖脂囊泡的相互作用。物理评论快报，107(18)页188103。

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