共聚焦显微镜和Imaris软件能有效地用于抗击SARS-COVID-2吗

严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)是目前最知名的冠状病毒家族成员。冠状病毒是一个病毒家族，从引起普通感冒症状的病毒到毒性更强的MERS(中东呼吸综合征)和SARS(严重急性呼吸综合征)。

了解独特的RNA复制过程，明确冠状病毒致病机制，了解宿主免疫病理反应，可以显著提高我们设计疫苗和减轻疾病负担的能力(Fehr et al. 2015)。研究可以通过荧光标记或免疫标记病毒蛋白质或RNA链来进行，因此有可能对单个病毒或病毒生命周期中的种群动态进行成像。

这些小病毒(冠状病毒约125纳米)的成像和可视化处于传统光学显微镜分辨率极限的边缘，需要超分辨率共聚焦显微镜技术(Parveen et al. 2018)和高灵敏度的“单分子能力”。电子倍增CCD (EMCCD)相机．用Imaris软件平台成功分析了培养物(固定或活)中荧光标记细胞的图像，揭示了病毒感染过程的几个方面。

使用共聚焦显微镜和Imaris研究冠状病毒

先进的光学显微镜技术和Imaris 3D图像分析软件的结合导致了一些发现，帮助研究人员了解病毒-细胞相互作用的几个方面。

病毒与宿主细胞的相互作用和进入机制

在Dijkman等人2013年的工作中，共聚焦图像拍摄了人气道上皮(HAE)感染细胞培养物。这些图像使用Imaris软件进行分析。具体使用Imaris Coloc中的3D表面渲染和共域量化，如图1所示。研究结果最终提高了对病毒宿主相互作用的理解。

人冠状病毒细胞向性的定量研究。(A)有代表性的透明、三维渲染的HCoV- 229e感染和对照HAE细胞培养的z-stack图像显示了HCoV细胞向性的定量方法。培养物用抗β-微管蛋白IV(纤毛细胞;红色)，ZO1(紧密连接;红色)，NSP8(复制复合物;黄色)和dsRNA(病毒dsRNA;绿色)和DAPI(细胞核;蓝色)。(B)四株当代HCoV株在96 hpi时dsRNA与非纤毛细胞(白色条)和纤毛细胞(黑色条)共定位的百分比。结果显示为2个独立实验中随机选择的5个领域的平均值和标准差。 **, P < 0.01; ***, P < 0.001 (two-tailed, unpaired t test).

另一项研究分析了MERS(中东呼吸综合征)等冠状病毒的病毒感染部位和进入机制。在这里，使用Imaris Coloc测量了病毒颗粒与富含四胱胺素的微域(TEMs)的共定位。研究人员将TEMs确定为病毒蛋白水解位点，从而更精确地定义了病毒启动的亚细胞位置。这些发现的意义延伸到病毒进入拮抗剂的使用，如蛋白酶抑制剂，当定位到这些微结构域时可能最有效。(Earnest et al. 2015)。

宿主细胞内的冠状病毒复制机制

宿主细胞内冠状病毒复制机制的研究(Muller et al. 2017)，使用Imaris Coloc未揭示细胞质磷脂酶2α (cPLA2)活性与各种+RNA病毒家族的50种复制密切相关，因此可能是51种广谱抗病毒药物开发的候选靶点。

宿主对冠状病毒感染的免疫病理反应

在Kehrl实验室进行的两项独立研究中，Imaris被用于更好地了解SARS-CoV期间发生的严重肺部病理的分子机制(Yue等人，2018年)，以及SARS-CoV如何激活细胞应激通路并靶向先天免疫反应(Shi等人，2019年)。在研究中，研究人员使用Imaris Coloc进行共定位，并使用Imaris Cell来量化细胞内的点状细胞。

该研究还使用Imaris计算多个载片上多个核内点状蛋白数量的能力(Ahn et al. 2019)来量化细胞内含有CARD (ASC)斑点的凋亡相关斑点样蛋白，以应对“无菌”刺激和多种人源性病毒感染，包括甲型流感病毒(−单链(ss) RNA)、马甲病毒(PRV3M，双链RNA)和中东呼吸综合征冠状病毒(+ssRNA)。

病毒在宿主细胞内运输和组装的途径

在另一项研究中(Lakdawala et al. 2014)，使用Imaris显微镜图像分析来探索流感病毒生产感染期间vRNA的组装和运输。该小组使用荧光原位杂交(FISH)在单个细胞中观察到四个不同的vRNA片段。用Imaris Coloc对细胞质内的vRNA片段进行共定位，用Imaris Spots and Surface模型评估病毒病灶与细胞核的距离。

Imaris也被用于追踪细胞内的细胞质RNA病灶，并创建均方位移(MSD)图。

研究的未来

公众的目光现在集中在那些试图寻找和测试SARS-Covid-2疫苗潜在候选的科学家身上。本研究涉及大量活细胞和固定细胞的共聚焦显微镜研究。目前的研究状态表明，Imaris是一个完美的数据分析工具，因为其广泛的分析功能提供了宝贵的定量信息，这与Imaris平台独特的易用性相结合。

总结

Imaris主要用于研究冠状病毒感染的定位和机制、复制途径及其对宿主细胞影响的机制。用共聚焦显微镜获得培养物(固定或活)中荧光标记细胞的图像，并用Imaris进行分析，主要使用:斑点和表面，量化共定位系数(Coloc)，计算细胞内斑点的数量(Imaris细胞)，斑点和最短距离测量和跟踪。

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