活线粒体-如何克服成像动态过程中的挑战

挑战背景

线粒体提供细胞能量，因此是真核细胞的必需细胞器。线粒体动力学的缺陷与急性综合征，如神经变性障碍，心血管障碍和神经素描物疾病有关。

Mitochondria中的显微镜需要，这些细胞器具有复杂的内部结构，具有两个膜，光滑的外膜和极曲折的内膜。除了膜架构线粒体外，线粒体小，尺寸靠近光学显微镜的分辨率极限。此外，线粒体是极其动态的细胞器，其沿着细胞内空间分开，熔丝，改变形状和行进。所有这些特征都是对研究其动态行为（裂变和融合）进行成像的障碍物，以及导致融合或裂变的潜在快速信号传导过程。

当成像活线粒体时，除了活体成像的关键挑战，包括光毒性、光漂白，需要克服其他问题。必须以高时间和空间分辨率获得图像。事实上，为了实现空间和时间线粒体动态的最全面的图像，有必要在4个维度（3D +时间）中获取图像数据。即使对于固定的线粒体，即使是由于其大小和复杂性，高空间分辨率也是必不可少的要求。

技术解决方案

基于相机的共焦系统是Live Mitochondria成像的更好解决方案，其不会因光毒性而损害细胞活力。设备需要以快速速度和高成像分辨率获取。

• 速度-线粒体动力学和钙信号的可视化需要一种可以同时获取多个通道的仪器，由于事件的快速特性，显微镜需要以非常快的速度获取。
• 分辨率-显示线粒体运输所需的分辨率在XY的50-100 nm窗口内。光学显微镜的衍射极限在200 nm左右;因此，需要使用克服衍射极限的技术，即超分辨率技术。
• 活细胞超分辨率-超过光学显微镜衍射极限的超分辨率技术通常需要获得大量的帧数(大约10^3.到10.⁴图像）和/或具有高光强度的成像。在大多数情况下，样品制备复杂，并且还存在特定荧光团的要求。所有这些要求呈现与实时电池成像不兼容的最新可用的超分辨率技术。

图1 - 用Mito跟踪器染色的Live Celler在宽地，共聚焦和共焦+ SRRF流中获得的图像。通过SRRF流图像的宽地，共聚焦和共焦之间可以观察到分辨率的增加。使用蜻蜓与SRRF流，科学家可以获得线粒体的Live-Cell超分辨图像。

ANDOR用于成像线粒体的解决方案

由于其速度、灵敏度和分辨率，蜻蜓是成像活线粒体的完整解决方案。高灵敏度相机允许检测非常微弱的信号与高量子效率。使用Dragonfly和Andor的背光Sona或iconson EMCCD系列相机可以实现超快的微光成像。如共聚焦旋转盘、dSTORM超分辨率(分辨率~ 20 nm)等成像方式都可以用于蜻蜓的线粒体研究，且每种成像方式都具有优势。

重要的是，任何模态都可以与超分辨率技术SRRF（超分辨率径向波动）组合。SRRF-Stream兼容实时电池成像，提供高速超级分辨实时成像的优势。