单分子研究的最佳探测器是EMCCD还是sCMOS?

有了一系列高灵敏度的检测器，其中一个最具争议的领域，最合适的检测器，是最确定的单分子研究。由于EMCCD提供单光子灵敏度的独特能力，它已成为许多单分子研究的首选探测器。最新背景sCMOS提供增加量化宽松到相当水平EMCCDs以及高速度和sCMOS闻名的视野,这是现在足够背景sCMOS相机取代EMCCD相机单分子应用?bob综合app官网登录

在本文中，产品专家专家贾斯汀库珀博士兼艾伦·穆拉博士讨论了他们在不同的相机技术上提出的一些最常见的问题以及如何影响他们对单分子研究的适用性。

首先，什么是单分子研究?它们的用途是什么?

“在单分子研究中，一种方法是对孤立的单个荧光分子发出的光进行成像。这些分子可以是单个的小分子，也可以是用于标记更大的大分子，如蛋白质或DNA，甚至更大的细胞内结构的荧光团。随着时间的推移这些分子可以本地化和跟踪可产生的时空分布信息感兴趣的分子和其他现象,可以诱发的位置或荧光强度的变化分子化学反应等大众运输,bio-recognition等等。此外，在单分子事件的水平上研究现象，使人们可以探测系统内在的非均匀性，否则，由于体积方法的集合平均将丢失这种非均匀性

“单分子技术已经发现了来自材料科学的各种应用，其中单分子已被用于探测分子距离尺度的表面化学物质，以对它们应用于热力bob综合app官网登录学和动力学的研究的生物物理学杂交或免疫反应机制。单分子技术的最重要应用之一已经应用于基于定位的超分辨bob综合app官网登录率成像。“ - 我

单一分子研究最常用于哪种技术？

“我们在这个研究领域看到的一些最常见的技术是全内反射荧光(TIRF)显微镜和光板显微镜，它们被用作从显微镜系统景深以外的光线中还原背景的方法。常用的单分子测量技术有荧光相关光谱(FCS)，可用于测量小分子群的扩散;弗雷斯特共振能量转移(FRET)，用作“分子标尺”，测量10纳米的距离尺度。FIONA、PALM、STORM、DNA PAINT等基于定位的超分辨率技术以及这些技术的组合也是单分子成像的一大应用空间。这些方法的主要目的是提供关于潜在的细胞过程的信息，否则隐藏在标准衍射极限以下，以及由于在照明路径的聚焦光。这使得我们有可能观察在复制过程中蛋白质对DNA的定位或动态，或标记蛋白与细胞膜上特定受体的结合。使用FRET或荧光寿命成像(FLIM)的研究使您能够在分辨率≤10 nm的情况下观察生物分子随时间的相互作用。FCS是另一种非常有用的技术，似乎正在成为科学家工具箱中更常见的工具，因为它可以提供有关扩散速率等数据

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单分子成像探测器最重要的方面是什么?

“我认为最重要的参数是灵敏度。单分子研究的应用可能受到光子的限制，因为与体积测量bob综合app官网登录相比，单分子本身产生的光子数较低。根据所使用的特定荧光团和测量的时间分辨率要求，单分子技术可以迅速找到方法，在每次捕获的单光子的光水平。荧光探针/染料对光漂白也非常敏感。因此，相机必须足够敏感，以检测每像素非常低的光子数——这可能是每像素10光子或更少。探测器有自己的噪音层，以阅读噪音和暗噪音的形式存在。如果相机的噪声底过高，那么我们就无法检测到我们需要的图像信息。EMCCD相机，如Ixon Ultra.具有单光子灵敏度，有效地忽略读噪声。背光sCMOS相机通常有~1.5-1.8的电子阅读噪声。通过使用EM增益，我们可以将噪声底限降低到可以忽略的水平，提高信噪比。-JC(如下图所示)

上图:增加iXon EMCCD相机的EM增益，使单分子信号进入视野，大大提高信噪比。

像素大小重要吗?

“是的，这是灵敏度之后第二个最重要的参数，因为被称为点扩散函数的单分子图像需要充分采样，以获得光学成像系统的全空间分辨率。应用奈奎斯特采样理论，并使用典型的高NA物镜，对100倍物镜而言，像素大小~11µm是理想的。巧合的是Sona背光sCMOS像素的大小。60x时，6.5µm为最佳。iXon Ultra 888有一个13µm像素，这是120x的最佳。然而，通常使用额外放大率，有时称为透镜耦合器，以调整取样以适应应用。在其他应用中，有时bob综合app官网登录像素大小和过采样不是很重要，但考虑到单分子研究的性质及其在定位技术中的大量使用，它往往是非常重要的。”——我

EMCCD相机的QE和背光sCMOS的QE是相似的，那么EMCCD相机如何在较低的光照水平下提供更好的灵敏度呢?

EMCCD和背光sCMOS相机都显示高达95%的QE。这意味着在硅传感器中有95%的概率光子被吸收并转化为电子。在超低信号水平下，即使95%的QE也不足以产生足够的信号来克服读噪声。使EMCCD技术更加敏感的主要因素是EMCCD相机中的电子倍增增益寄存器。一个光电子将通过一系列读出寄存器像素被放大许多次，这一过程称为碰撞电离。这样做的结果是低电平信号被显著放大(高达1000倍)。通过打开EM增益，你现在可以看到低电平信息，否则这些信息会隐藏在相机的读取噪声之下。“我

注:有一个完整的描述EMCCD技术在andor学习中心。

EMCCD相机的一个潜在问题是EM增益噪声-这是什么，这会影响单分子研究吗?

电磁增益噪声，有时也称为乘性噪声因子，是由于电磁增益放大本身而产生的噪声。当电子从增益寄存器内的每个像素传递时，产生额外电子的概率非常小。由于这在EM增益处理过程中执行了许多次，对信号进行了额外的变化。有效的做法是将信号的散列噪声增加一个因子Ö2(1.41)。散粒噪声是信号本身的内在变化，来自泊松计数统计——这对于特定的光子通量是无法减少的。电磁噪声应该被认为是其中的一个额外组成部分。因为散粒噪声的平方根成正比的光子数信号,电磁噪声只成为一个重要的组件的整体噪音信号的水平更高,这就是为什么sCMOS相机往往有更好的信噪比更高的光强度。然而，在单分子实验中，电磁噪声是一个小得多的噪声成分，考虑到涉及的超低光水平，导致emccd在单光子光水平的较高信噪比。”——JC

背光sCMOS相机有更高的帧率-它们是否更适合研究像蛋白质和膜关联这样的单分子动力学?

“不一定 - 它不仅仅是相机可以运行的帧速率。为了检测足够的光子，需要相应地设定曝光。由于它们的放大能力，EMCCD相机通常可以使用较短的曝光时间，这意味着有效的帧速率可能更高，您可以获得更好的时间分辨率。此外，当适当裁剪时，EMCCD可以接近背照射SCMOS传感器的帧速率，同时仍然保持从这些短曝光中放大信号的能力。“ - 我

“如果需要更广泛的视野是必需的背光照相机4.2 Sona b-11可能更适合与EMCCD，你可能不得不减少感兴趣的区域，以获得所需的帧率。这取决于具体的应用。“jc

你是否看到在单分子研究中越来越多地使用背光sCMOS ?

“看看这一直很有意思，因为现在已经介绍了几年后的后照相机，并且许多研究组在这些相机上做了比较测试。这尤其重要，因为它们正在处理广泛的现实世界应用，而不仅仅是我们能够与之密切合作的研究组的较小选择。bob综合app官网登录-是

“背光sCMOS摄像机现在被用于单分子研究。它们的实现得到了一些发展的帮助，如一些新的更高的量子产率荧光体，但由于在单分子光水平方面的多功能性，像iXon Ultra系列这样的EMCCD相机看起来将在一段时间内保持强大的立足点。这与其他光线不受限制的成像领域形成了鲜明的对比，我们已经看到背光sCMOS成为了清晰的选择，以及上一代正面照明的sCMOS相机，如theZyla 4.2 +这对一般荧光显微镜来说很好。“jc

返回照明的SCMOS相机何时将是单分子研究领域更合适的选择？

“一些单分子研究可能并不在EMCCD占主导地位的最低光照范围内——并不是每一个应用都是真正的超低光照，现在有一些明亮的合成探针。背光sCMOS在某一交叉点后应该提供更好的信噪比，所以对于这些不太缺光的应用，背光sCMOS相机应该更合适。bob综合app官网登录“我

“也可能有应用需要非常广泛的视野。bob综合app官网登录在这些条件下，背光sCMOS探测器(如Sona 4.2B-11)可能是更好的选择，因为你可以在每张图像中覆盖更多的样本区域。此外，如果时bob综合app官网登录间分辨率不是问题，曝光时间可以设置得足够长，从而有一个更大的信号电平，则更适合使用背光sCMOS相机。当然，没有两个应用程序是完全相同的，bob综合app官网登录所以很重要的一点是要很好地理解实验条件，并在可能的情况下，在样品和实验条件上演示潜在的摄像机，这将是您的研究的典型。“jc

SCMOS相机具有比CCD或EMCCD更多的像素到像素变化 - 单分子研究中的哪种重要性是多么重要？

“这是另一个有助于使EMCCD适用于许多应用的因素，特别是在本地化准确性重要的情况下。bob综合app官网登录由于更复杂的读出过程，SCMOS相机的像素到像素变化较高。该读数过程确实能够实现更高的读出速率，但是在像素响应均匀性（PRNU）方面存在权衡。在SCMOS传感器中，每个像素具有其自身的像素放大器，因此这意味着每个像素将具有唯一的读取噪声分量，并且每个像素对光具有略微不同的响应。这表现为相机噪声底板上的固定图案噪声。对于单分子实验，其中信号电平非常接近相机的噪声地板，添加的像素到像素变化可能会影响定量强度信息，以及定位精度。较大的变化由施加用于SCMOS传感器的独特像素映射，其略有减轻，该SCOS传感器用于校正变化。冷却传感器还减少了SCMO中的热像素等像素噪声的影响。然而，CCD和EMCCD传感器具有更简单的架构和读出过程，因此具有更好的强度响应均匀性，并且基本上没有固定模式噪声。因此，像素到像素变化对于某些研究是考虑因素，因此重要的是要意识到这一点。“ - JC

总之，EMCCD和新的背光sCMOS相机都具有独特的优势。像iXon EMCCD这样的EMCCD相机具有最高的灵敏度，可以测量单个光子。然而，背光sCMOS，如Sona，提供大视场与快速帧率的结合，灵敏度仅略低于emccd。必须考虑每个应用程序的需要，以确定哪一种相机将是最合适的选择。考虑到单分子领域的广泛实验范围，建议在高要求和常规样品上演示两种技术的摄像机，看看哪一种最适合您的实验需要。