胚胎发育的薄片显微镜成像

现在，利用Neo sCMOS结合光片显微镜技术的特殊捕获率，可以以优异的时间分辨率观察神经系统的整个发展。

在Janelia Farm研究园区，Philipp Keller和他的同事开发了单光子和多光子SiMView技术，并在整个发育过程中以30秒的时间分辨率记录了整个果蝇黑腹动物胚胎的细胞动态。SiMView顾名思义，它是基于单光子和多光子的光片同时多视图成像技术，它克服了连续多视图策略的局限性，能够在大样本中对快速动态事件进行定量系统级成像。SiMView包括一个带有四个同步光学臂的薄片显微镜，用于以每秒1.75亿体素的速度长期基于scmos的图像采集的实时电子设备，以及用于高通量图像配准、分割、跟踪和实时管理每个样本记录的tb数据的计算模块。

凯勒的主要研究重点是了解发育中的神经系统。作为神经系统的模型系统，果蝇是一个极好的候选者。在这项研究中，表达elav(C155)-GAL4和UAS-mCD8::GFP或Ftz-ng-GAL4,10XUAS-IVS-myr::GFP的转基因胚胎被用于可视化所有有丝分裂后神经元，并对整个胚胎神经系统进行延时单光子和多光子SiMView成像，以捕捉中枢和周围神经系统的发育，并以优异的时空分辨率揭示轴突生长动态的细节。

Keller的SiMView成像平台使用四个独立操作的光学臂的正交排列。其中一对光学臂用于双向光片照明，具有两个长工作距离的物镜。另一对，安排在一个直角的第一个，用于双向荧光检测与高数值孔径物镜。在这种设置中，样品位于一个25毫升的腔室中，从四面都有全光学通道，可以同时进行四个目标的光片照明和荧光检测。通过将显微镜分成两个水平层，实现了全光学访问和最大标本定位控制。所有光学系统都位于上层，而标本定位系统是直立的，与以前的光片显微镜相反。这样做的好处是样品可以嵌入异常柔软(0.4%)的琼脂糖凝胶中，这可以在生理条件下对整个发育中的果蝇和斑马鱼胚胎进行长期成像。

对胚胎发育阶段的不同看法

为了在果蝇胚胎的整个发育过程中，同时使用两台Neo sCMOS相机获得数百万张高速和高分辨率的图像，Keller和他的团队在高性能实时控制器上控制整个SiMView系统。控制器以350 MB s-1的速率与主机工作站通信以协调同步采集。该控制框架执行校准显微镜的四个光学臂与亚微米精度直接对每个标本，使用自动聚焦和轻片定位的自动化软件模块。

由于对整个胚胎进行光片显微镜观察时产生的数据量，Keller设计了SiMView计算主干，用于高速成像实验，可连续采集图像长达数天。该系统能够在不间断高速成像会话中记录超过100万张高分辨率图像，每个样本的总数据集大小为10 TB。除此之外，Keller的团队还有一个基于10千兆s-1玻璃纤维网络的二级采集管道，允许记录多达1000万张高分辨率图像或每个样本100 TB的长期成像会话。用于无损三维小波压缩的SiMView实时数据压缩模块允许1拍字节的最大记录容量。

通过对SiMView、单视图和连续多视图获得的图像进行比较分析，Keller得出结论，SiMView成像比单视图成像提高了近四倍的覆盖率，并揭示了整个早期胚胎的细胞动力学。此外，与连续多视图成像相比，SiMView成像显示了几个优点:它消除了快速细胞运动期间的时间和空间融合伪影，提高了时间分辨率，并为后续的计算图像分析(如自动细胞跟踪)提供了定量数据。重要的是，SiMView通过避免连续多视图图像配准所需的重叠区域的连续获取，减少了对标本本身的光漂白和光毒性效应。此外，SiMView显示亚细胞水平的详细信息，这在连续多视图成像中是错误的。此外，SiMView准确地记录了快速的局部核运动，而顺序成像往往会导致重复的结构和扭曲的核形状。

单光子SiMView对于小穿透深度提供了优越的信噪比，但未能捕获胚胎内部深处的结构。相比之下，双光子SiMView相比减少了自身荧光，即使在发育后期也能提供接近完整的胚胎物理覆盖。

根据Keller的说法，SiMView成像技术为整个发育中的生物的高通量高含量筛选、快速功能成像和细胞动力学的全面定量分析打开了大门。

光片显微镜的Andor解决方案

Andor公司的sCMOS相机是高速光片显微镜的理想探测器。Neo 5.5、Zyla 5.5和Zyla 4.2都提供了大视场和高分辨率，而不影响读取噪声或帧率，6.5 μm像素尺寸非常适合于光片显微镜。6.5微米的小像素尺寸确保了pointspread函数足够的过采样，即使对于低放大倍率的目标(例如10x NA 0.3;20x NA 0.5)。即使与性能最高的慢速读出ccd相比，读取噪声也非常低。Zyla 5.5可以实现低至1.45 e- rms的读噪声，而Zyla 4.2的读噪声为1.1 e- rms，两者都没有信号放大，同时以每秒100帧的速度分别读取550万像素和420万像素。