用于高光谱成像的emccd

测量生物系统的光谱特性的原因是多方面的。原生或染色的组织和细胞以这样一种方式吸收和发射光，从而留下明显的光谱特征。光谱学通过这种独特的指纹光谱为我们提供了一种直接识别和量化物质的手段，可以被认为是一种“化学视觉”。例如，通过测量组织学和细胞学样本的光谱谱线的细微变化，甚至通过使用光纤探针测量体内组织的光谱谱线，就可以确定肿瘤的发病和性质。光谱检测也可用于检查视网膜疾病状态。在荧光显微镜中，固定或活细胞通常用多个荧光探针标记，每个荧光探针针对特定的细胞内成分。接下来的挑战就变成了——我们如何从这组荧光标签中分离出各种不同的、但通常在光谱上重叠的信号，使我们能够建立一个精确的、高对比度的、定量的、被研究的细胞内成分的位置、浓度和相互作用的表示?这是一个重要而合理的挑战，因为在后基因组时代，涉及多重标记的现代技术正在彻底改变我们直接探测和理解蛋白质功能和细胞的关键生理机制以及相关疾病状态的方式。最后，拉曼光谱虽然是一种固有的微弱现象，但与典型的荧光波段相比，拉曼波段具有非常窄的带宽，这是其相当大的优势。因此，拉曼光谱是多个空间重叠物种的理想光谱识别方法，当与反褶积和多变量分析相结合时，就更加强大了。

光谱成像的概念，生成超过第三个光谱维度的定量二维空间图像，以产生“数据立方体”，最初已在空中监视或卫星成像等领域得到证实，以生成详细说明测试区域化学成分的光谱数据。这样的配置可能涉及将一条输入信号线聚焦到成像光谱仪中，从该线产生的光谱分散光投射到成像CCD的一个区域上。通过CCD以足够快的帧速率工作，机载飞行器和附带的探测系统在地面上被“扫描”，3D信息迅速建立起来。数据立方体可以通过两种主要方式来查看:a)可以从图像上的任何空间点推导出光谱

重叠荧光蛋白发射光谱的示意图表示。通常还显示广泛的自身荧光。

当光谱分散在许多光谱通道(在使用ccd的情况下是像素)上时，这种技术通常被称为超光谱成像或多光谱成像。在监测等领域中，光谱成像方法的发展已经持续了20多年，从中获得的许多信息可以用来帮助解决生物学问题。

在荧光显微镜中，特别是在活细胞上，多光谱成像的概念正被视为一种从广泛标记的样品中收集完整和详细动态信息的手段。定量光谱“解混”算法(其中有一些存在)可以应用于从每个图像点解卷积光谱到其组成发射种及其相对贡献。重要的是，解混可以成功地应用于多种染料有显著光谱重叠的情况。这有助于在共定位和FRET等技术中使用荧光蛋白，如GFP及其最常见的突变CFP、YFP和ds-RED。FRET，就其本质而言，特别容易产生显著的光谱“串扰”。对于高效的FRET，需要在供体染料的发射光谱和受体的吸收光谱之间有显著程度的重叠。这种情况通常不可避免地伴随着两个发射光谱的相当大的覆盖，就像常见的FRET对GFP/YFP一样。

通过使用窄带滤波器的组合，可以成功地实现FRET，并将光谱不同的图像分割到两台摄像机或同一摄像机内的相邻视场(目前最多可以实现四个视场)。对供体和受体物种的激发，以及随后从两个“基于滤波器的通道”中分离，可以执行以最大限度地减少串扰的影响。这种方法具有提供两个或三个荧光团的快速和同时成像的优点。然而，当我们处理大量的荧光团时，特别是当它们在光谱上显著重叠时，串扰成为一个更大的问题，我们需要更多的光谱通道来有效地分离信号。然而，可以想象的是，我们不是使用窄带滤波器从紧密重叠的荧光团中分离信号，而是执行快速多光谱成像并收集完整的未经过滤的发射光谱，然后进行分解。如果可以实现这种配置，就可以获得更好的信噪比图像，因为我们不必通过使用窄带滤波器“丢弃”大部分发射光子。此外，通过光谱成像和分解，我们还可以分离并去除样品中的任何自发荧光。

然而，虽然这种多光谱图像分离方法的好处是实质性的，但也存在技术挑战。理想的光谱成像系统应具有若干关键属性。它将能够快速收集光谱数据，以最快的速度生成数据立方体，促进动态样本的吞吐量和研究。该系统在高光学通量、最小的探测器噪声和最大的探测器量子效率(QE)方面足够敏感，从而产生高信号对噪声-已经表明，在这种条件下，光谱解混的效果要大得多。光谱分辨率应足以有效地分离组成贡献种-实际所需的光谱通道数量由以下因素驱动:a)贡献重叠种的数量

B)我们是否可以使用现有的参考发射光谱进行解混(或者我们是否记录了“未知”)。如前所述，如果该方法涉及在波长范围内收集整个重叠光谱，从而避免使用窄带滤波器作为检测通道，则无需浪费光子以实现所需的光谱分辨率和分离，从而获得更高的信噪比(S/N)、更好的分辨率和更准确的量化。

安多的EMCCD技术是超灵敏光谱成像设备的理想选择。所提供的非凡S/N明显大于在快速读取速度下运行的传统CCD相机所提供的。此外，由于它是一个快速读取成像设备，EMCCD产生的帧率非常适合动态FRET事件或记录更快的数据集。在所有活细胞的直接成像研究的基础上，都希望通过最小化光毒性细胞/组织损伤和合并荧光团的光漂白来尽可能长时间地保存活体。因此，该技术得益于EMCCD检测技术，该技术不仅显示出从弱发射物种中捕获具有高信噪比的光谱分辨图像集的灵敏度和速度，而且进一步使激光激发功率衰减。通过最小化激发功率，染料光漂白率和细胞光毒性显著降低。

传统的ccd光谱解析波长的方法是使用色散元件，如光栅，它将波长分离的光投射到阵列的一维上。事实上，专门的光谱CCD格式是专门用于这种用途的——这些格式往往在形状上被拉长，典型的像素格式是1024 x 128或1600 x 200。在标准光谱读出模式下，光沿较长的水平维度分散，给出> 1000个“光谱通道”，垂直列在芯片上进行分箱(完全垂直分箱)，创建更大的光收集区域，加快了可获得的光谱帧速率。

线照明的光谱色散

高端的iXon3 EMCCD相机由安多首创，包含成像传感器格式，如512 x 512或1000 x 1000。这些已经适用于标准光谱模式，沿垂直柱尺寸执行广泛的垂直分箱。然而，一种专用的光谱学EMCCD相机最近已经被开发出来，这就是Andor的NewtonEM EMCCD相机。这款USB 2.0， -90°C热电(TE)冷却平台有1600 x 256或1600 x 128像素格式，最适合快速微光光谱应用。bob综合app官网登录

通常还需要其他有用的光谱学方法来读取emccd。例如，可以使用成像摄谱仪，如安铎公司的三叶草303i，它将沿着入口狭缝的尺寸提供空间分辨率。EMCCD可以被解读为一个完整的图像，光谱分辨率沿水平轴和垂直于此的垂直空间维度。传感器甚至可以沿着阵列读出多个水平轨道，其大小和位置由软件可配置，每个轨道给出一个单独的频谱，例如，对应于样本中某一点的光纤输入。

快速动力学读数

如果我们需要实现极快的光谱速率，有两个选项可用，但对于每个选项，我们必须能够确保光仅分散在传感器上有限数量的行上，而没有光落在活动区域的其余部分。最快的时间分辨率是通过在“快速动力学模式”下读取成像EMCCD来获得的。在这种配置中，光谱分散在传感器最顶部的几行上。下面的“暗行”随后用于存储从暴露区域向下移动的光谱，这一直持续到整个传感器被填满-然后整个区域被正常读出，软件处理多个光谱。因此，可以实现将这些行向下移动一步所花费的时间分辨率，在Andor iXonEM+ EMCCD范围内可调至< 1μs/行，最多可达1999行存储。

如果你的实验要求你既需要快速的光谱时间分辨率，又不受传感器存储大小的限制，那么在“裁剪传感器”模式下读取EMCCD是可行的。在这种模式下，我们可以“欺骗”传感器，让它认为它比实际要小，并以更快的帧速率连续读取!光谱时间分辨率由读出传感器较小的定义部分所花费的时间决定。例如，通过将分散的光聚焦在iXonEM+ DU885-K底部的10 x 1000区域上，以35 MHz像素读数，然后可以以10秒/秒的速度读取数千个光谱。

裁剪传感器模式

到目前为止，许多新的光谱成像技术已经实现，这些技术利用了emccd的快速读出和超灵敏特性。

目前正在研究的一个领域是下一代多光谱共聚焦扫描。许多商业系统的多光谱共聚焦扫描显微镜存在，但有一些相当大的缺点。特别值得一提的是两种格式。一种配置包括使用光栅将来自每个扫描点的共聚焦信号分散到32个光电倍增管(pmt)的线性阵列上。这主要是由于pmt的QE明显较低(特别是对红色)和邻近渠道的不同反应。另一种当前的商业格式采用单个PMT进行检测，并在激光停留在图像点上的时间内在光谱范围内倾斜扫描光栅。不难想象，在一张512 x 512的250000像素的图像上进行光谱扫描需要相当长的时间，这样的配置不太适合动态系统的光谱研究，也会受到大量样本照明的不利影响。

为了克服这些性能缺点，可以实现多光谱共聚焦扫描EMCCDs系统。利用背光传感器的> 90%量子效率、单光子灵敏度、阵列结构和快速像素读出速度来显著改进这种方法。激光驻留时间应设置为与曝光和读出约32个像素的短行时间相一致——足够的光谱通道可以产生几种已知发射染料的有效分解，从而生成512 x 512 x 32的数据立方体，生成时间不到1秒(对于10 MHz的iXonEM+ DU887 -比35MHZ的DV-885更快)。用更少的频谱通道，仍可预期更快的速度。与通常使用的pmt技术相比，EMCCD像素具有明显的灵敏度优势，后者在蓝绿色区域约为5倍，在红色区域高达10倍。

线扫描光谱成像

也有可能通过使用包含透射色散光栅的模块(如inspector)在显微镜中进行多光谱成像。在这些系统中，光学原理的色散和探测有点类似于前面描述的机载监测。该装置安装在显微镜和EMCCD之间，光从x方向的光照线上收集，光照线来自滤光灯或激光。从线收集的光分散在EMCCD阵列的区域，甚至部分可用区域，以获得更快的帧速率和更低的光谱范围或分辨率。因此，EMCCD列上的像素提供了λ分辨率。y方向的扫描是通过移动样品增量通过一个电动阶段。对于每个阶段步骤(通常是512)，都需要暴露并读出阵列中被照亮的区域。emccd的超灵敏性能是这种方法的理想选择，可以实现更短的曝光时间和更快的读取性能。

EMCCD的性能可以很容易地应用于加速光谱成像方法，其中液晶可调谐发射滤波器被用于连续获取跨越光谱范围的λ堆栈图像，涉及整个区域的照明和成像，每次波长。这种技术传统上受到采集速度的限制，但由于EMCCD的灵敏度和读出速度的优势而得到了提高。

激发光谱成像也可以进行，通过扫描可调谐波长的激发源，分析产生的发射强度。光谱解混算法可以很容易地应用于以这种方式获得的数据。