发现释放如何帮助揭示钙在细胞周期进程中的作用

揭示钙在细胞周期进程中的作用

众所周知，钙离子在细胞功能的许多方面发挥着作用，但对钙在细胞周期中的作用的理解存在差距。由Mike White教授和Violaine博士(Sèe)在利物浦大学领导的研究使用了定向闪光光解来阐明细胞内钙在细胞周期中传递信号的作用。

图1。同时负载NP-EGTA(笼状钙)和Fluo-4(钙染料)的Swiss 3T3细胞的单细胞照明。箭头表示照明前(A)和照明期间(B)的照明单元。荧光的增加表明被照射细胞中钙的释放。(C)光照30秒后，钙水平恢复到基础水平。图片由Violaine博士提供Sèe，利物浦大学。

d型周期蛋白如CD1在细胞周期进程中起着重要作用。其水平随细胞周期的变化而变化，CD1蛋白的数量直接依赖于CD1基因的转录速率。CD1基因转录受多种转录因子调控，包括核因子κ B (NF-kB)，其通过CD1的转录调控来控制细胞的生长和分化。

尽管NF-kB似乎在细胞周期进程中发挥作用，但在生长因子刺激下导致该转录因子激活的细胞内事件尚不清楚。用生长因子或有丝分裂原刺激非分裂细胞会引起细胞内游离钙浓度的短暂上升。细胞内钙已被证明在细胞周期的G1/S和G2/M阶段发挥作用，但利物浦大学的研究人员想要发现更多关于它在G0-G1过渡中的作用。

使用靶向光解来释放活细胞中的钙螯合剂和钙供体，使他们能够观察细胞如何精确地对(正常存在的)钙信号的缺失和钙水平的增加做出反应。这使他们能够理解钙在CD1基因转录和随后的细胞增殖中所起的作用。

为了研究血清诱导的细胞内钙增加的长期作用，研究人员需要一种非侵入性的方法来消除这种短暂的增加。他们使用了笼子里的钙清除剂Diazo-2。在360纳米的照射下，其对钙的低亲和力增加了30倍。为了消除血清诱导的钙峰，他们在血清诱导后对重氮-2负载细胞施加光照。重氮-2光解抑制了血清诱导的钙峰值，而不影响随后的细胞内钙水平。

研究人员使用MicroPoint系统将Diazo-2置于感兴趣的细胞中，将其暴露在长达10秒的360nm光的4秒闪光中。他们同时对样本进行了成像和光刺激，因此可以用延时共聚焦显微镜跟踪目标细胞和正常细胞。通过这种方式，他们直接监测了脱笼对细胞内信号传递和细胞命运的影响。

Violaine Sèe解释说，他们没有检测到NF-kB转位进入细胞核，也没有检测到NF-kB共识和CD1启动子在靶细胞中的NF-kB依赖基因转录。这些事实表明，血清诱导的钙峰似乎是下游事件的信号。

图2。血清刺激可促进p65向细胞核的转运以及IκBα的降解。

为了进一步研究短暂的钙增加与后来的NF-kB激活之间的关系，他们对笼中钙供体NP-EGTA进行了靶向光解。活化的NP-EGTA导致细胞内钙含量瞬间增加22%。这种增加与血清刺激的增加幅度相同，但它没有诱导可检测到的p65转位到细胞核。

使用笼状分子抑制和复制血清诱导的钙峰值的结果表明，NF-kB易位和基因转录的下游调控依赖于细胞内钙的短暂增加，但激活NF-kB需要其他依赖于血清的信号。这些结果与其他实验相结合，使研究人员提出G0-G1转变依赖于有丝分裂激酶活性以及钙信号，NF-kB激活在这些有丝分裂信号转导到细胞核中起着关键作用。

“这项研究表明，钙在细胞周期中起主导作用。钙离子在细胞功能的许多方面都有牵连，但它在细胞周期中的作用尚未得到很好的描述，”Violaine Sèe说。“我们发现钙可以通过激活丝裂原激活蛋白激酶- nf - kb途径来启动细胞周期。”

设备清单

• 采用蔡司激光扫描共聚焦显微镜进行延时成像
• 采用MicroPoint 365 nm染料池进行笼化