安铎解决FRET的方案概述

烦恼(有时称为Förster共振能量转移)可以确定两个荧光团的接近程度。烦躁是许多问题之一单分子技术如TIRF、SIM和超分辨率本地化等近年来流行的技术。共振能量转移只发生在非常短的距离，通常在10纳米内，并涉及激发态能量从供体荧光团直接转移到受体荧光团，以替代来自供体的荧光发射衰变。在能量的转移，受体分子进入激发态，从它衰减发射(总是比受体发射的波长长)。通过刺激供体，然后监测相对供体和受体的排放，无论是顺序的，还是同时的，可以确定何时发生FRET，以什么样的效率。

荧光团可用于标记感兴趣的生物分子和距离条件烦恼与大多数生物分子的直径(1- 10nm)相当。这意味着FRET因此可以被用来确定何时何地，两个或多个这些标记的生物分子(通常是蛋白质)在其生理环境中相互作用。对应于显微镜图像中的特定位置的FRET信号提供了超过光学显微镜的光学分辨率(~0.25 mm)的额外距离精度。除了空间上的接近之外，为了使高效的FRET发生，FRET染料对还必须表现出供体的激发光谱与受体的吸收光谱的显著重叠。正是这一特点构成了FRET的实验悖论之一:

• FRET对的光谱剖面不能分离到重叠很差的程度，
• 然而，人们希望避免两个成像通道之间的“交叉对话”，即理想情况下，供体发射滤波器组必须只收集来自供体的光，而不收集来自受体的光，反之亦然。

在实践中，这可以通过使用短带通滤波器来实现，该滤波器仅从供体发射的较短波长侧和受体发射的较长波长侧收集光。这在一定程度上限制了典型曝光过程中来自供体和受体的光子通量，特别是当我们牢记这些测量是在降低激发功率的条件下进行的，这样我们就不会加速漂白的速度。这意味着超灵敏的探测器是必需的烦恼实验．
例如FRET染料对包括:

• BFP-GFP
• CFP-dsRED
• BFP-GFP
• Cy3-Cy5
• CFP-YFP
• Alexa488-Alexa555
• Alexa488-Cy3
• Alexa594-Alexa647
• FITC-TRITC
• 铽(III)荧光素
• DiSBAC4(3)-CC2-DMPE(电压敏感FRET对)

CFP-YFP FRET染料对的轮廓如下所示:

CFP-YFP FRET对的吸收光谱和发射光谱。

安多公司的iXon EMCCD相机，是否作为关键部件蜻蜓活细胞共聚焦成像平台，或在另一个共焦系统是完善的探测器解决方案的FRET成像。EMCCD能够实现高分辨率、高信噪比(S/N)的测量烦恼的交互整个成像区域或体积的细胞，并有助于解决低光子水平时，窄带滤波器的使用。当与仔细选择的过滤器集相结合时，它确保了FRET数据的高度完整性。由于emccd在任何读取速度下都克服了噪声下限检测极限，因此可以高精度地动态跟踪分子相互作用。此外，激发功率通常可以降低，这意味着光毒性和光漂白效应被最小化，因此分子相互作用可以持续更长的时间。有关检测器选择单分子研究的进一步信息，请查看文章单分子研究最好的检测器是什么?

1.Oh H-K等(2019)利用荧光共振能量转移横向流动免疫分析法(FRET-LFI)快速简单检测赭曲霉毒素A毒素11(5)，292;https://doi.org/10.3390/toxins11050292
2.Hu J.等(2018)结合金纳米粒子天线与单分子荧光共振能量转移(smFRET)研究DNA发夹动力学纳米尺度，10,6611-6619 10.1039/C7NR08397A
3.Chaurasiya k.r.， Dame R.T. (2018) DNA结合蛋白的单分子FRET分析。见:彼得曼E.(编)单分子分析。分子生物学方法，1665卷。Humana出版社，纽约，纽约
4.Jung, S.等人(2018)，单一过渡金属离子的结合/解离和氧化还原状态的实时监测。公牛。韩国化学。Soc。， 39: 638-642。doi: 10.1002 / bkcs.11443