在细胞核中定位基因区域

众所周知，基因在细胞核内的定位不是随机的，并在某些核功能中发挥作用。人们一直假设每个基因的表达局限于细胞内的特定区域，然而，对这种情况如何发生以及为什么发生的理解仍然知之甚少。活细胞内基因区域的重要性可以潜在地为整体基因表达如何受到细胞核内基因位置的影响提供更好的理解。这个问题是由Olivier Gadal在Université de上提出的图卢兹
以及他在巴黎巴斯德研究所的研究伙伴。Gadal博士及其同事提出，基因组的空间组织绝不是随机的，它在基因组转录、调控、DNA修复和调控中发挥着重要作用。

图1a -为了证实基因表达区域，荧光图像集通过Andor旋转盘共聚焦(Andor，贝尔法斯特，爱尔兰)获得，并创建三维最大强度投影。绿色为核孔，红色为核仁。间期细胞的选择通过手动和自动检测方法进行。首先采用人工方法，然后进行间相核的自动检测，以减少操作员诱导的变异。使用MatLabderived例程Nucloc (nucloc.org)。

图1b -对产生的感兴趣区域进行处理，首先提取三维位点坐标、核中心、核仁质心、核膜椭球和核仁体积。收集的数据点通过定制的质量控制程序进一步评估，该程序旨在校正色差，并消除用于定义理论核仁体积范围的测量参数内的物体。

图1c -显示了在核地标对齐后从大约2500个核获得的位点位置(绿色球体)的示例3D视图;红色球体表示核仁质心;黄色半球半径，1 μm;红色表面显示“中位”核仁。

图1d -然后创建结果测量的概率图。图3中的原子核如图4中的热图所示。虚线圈表示核膜的中间位置，红色虚线曲线表示核仁的中间位置，小红圈表示核仁质心的中间位置4。额外的统计抽样被用来确认地点和位置。

为了证实这些观察结果，Gadal在酿酒酵母细胞的m樱桃标记核仁中观察了gfp标记的共调节半乳糖和生物调节生物发生基因区域的形成。以前已经对基因区域进行了观察，但这些观察是从固定细胞中获得的，并且是二维的。Gadal选择以三维格式观察活细胞，这使得亚核基因区域的更完整和动态概率映射成为可能。他对细胞的观察主要有三个重要因素。首先是克服目前固定细胞的局限性，以及更好地预测基因区域的概率位置所需的空间细节的缺乏。同样重要的是克服基于传统光学显微镜技术的分辨率的物理限制;真核生物细胞核内的基因室大小通常被认为仅略大于典型光学显微镜提供的500纳米轴向分辨率和250纳米横向分辨率。最后一个考虑是需要自动获取大量图像，以更准确地评估基因区域。原子核内的随机运动需要大量的种群进行研究，因此需要大量的观测。由于在实验中采用自动化方法来选择间期细胞内的细胞核，因此拥有尽可能高分辨率的图像集是非常重要的。

Gadal转向Andor的旋转圆盘共聚焦显微镜(SDCM)来解决当前传统光学显微镜的局限性，并获得收集精确预测基因区域所需图像数量所需的必要高性能。在此过程中，他解决了在重复暴露中保持活细胞活力的需求，收集所需数量的观察结果以准确预测基因区域或区域，同时解决了自动选择和观察各自域内基因位点所需的分辨率要求。

与许多活细胞成像应用一样，在保持高分辨率(强度和空间)物体bob综合app官网登录的同时，成像速度是主要要求。通过荧光标记可见的活细胞容易产生光毒性和光漂白效应。显微镜的光路在管理有限的光预算方面提供了一定程度的帮助，但不能解释影响图像采集的所有因素。高数值物镜允许更多的对焦光被检测到，电子倍增CCD相机有效地放大信号，同时抑制背景噪声。旋转圆盘的加入有助于进一步提高信噪比，同时创造一个更温和、光稳定的成像环境。

成像速度
活酵母细胞被用来更好地了解共调节半乳糖和生物调节生物发生基因的概率位置。虽然之前的实验已经通过固定的酵母细胞确定了基因位置，但更高分辨率的地图是这项研究的最终目标。活细胞内的随机运动提供了这种环境，然而，必须仔细对待细胞，以正确地查看和绘制基因位置。与传统的宽视场或激光扫描技术相比，旋转圆盘共聚焦的孔径提供了一个更温和的成像环境，同时满足了可视化子分辨率细节所必需的分辨率要求。

解决子分辨率细节
一般认为光学显微镜环境下的横向分辨率约为0.25微米，轴向分辨率约为0.5微米。这些实验中的酵母细胞核估计为1.0微米的球体，对高分辨率的亚细胞特征进行了重要的动态考虑。通过使用高数值孔径物镜来限制导致分辨率损失的景深问题是可能的，然而，旋转圆盘针孔孔径的添加提供了更高分辨率的一系列图像，从中执行概率基因区域图所需的自动化分析。

收集大量数据
为了准确预测基因位置，有必要收集大量的酵母核。在这种情况下，为每个表达的基因获取大约2000个细胞，然后自动处理图像，只包括那些间期和表达感兴趣的基因。在传统扫描的基础上，考虑了三维深度。对于扫描的每个细胞群，首先获取41张轴向图像，以可视化细胞的整个体积，然后创建用于自动发现间期细胞核的最大强度投影。自动化核检测需要稳定和可重复的成像环境。没有它，自动化就不可能实现，需要更多的手工方法，这已被反复证明会降低实验的客观性和准确性。

Gadal博士的工作进一步完善了现有的研究成果，这些研究成果描述了真核细胞核内基因区域的位置和范围，并且比先前报道的时间更长。通过他的研究发现，相关基因的区域比预期的要小，这反过来又限制了基因与“彼此、核仁或核膜”的相互作用。研究结果表明，基因在核仁中的位置很重要，因为这些位置有助于确定基因是被激活还是被抑制。正是通过这些观察，核架构的作用远比以前设想的重要。旋转圆盘显微镜的作用有助于揭示这些排列，并使这些观察成为可能。