使用sCMOS相机的流动细胞荧光成像

荧光显微镜能够研究细胞的分子特异性和亚细胞分辨率。尽管最近在荧光标签的亮度和图像传感器的灵敏度方面有所改进，但成像通常仅限于静止细胞。在移动细胞中成像荧光从根本上来说是具有挑战性的，因为曝光时间受到运动模糊的限制，这限制了可用的信号。哈佛大学的Ethan Schonbrun和他的同事开发了一种方法，可以对在液体中以高线速度移动的荧光标记细胞进行荧光成像。流动细胞被伪随机激励脉冲序列照亮，导致运动模糊，可以通过计算除去，以产生接近衍射限制的图像。利用该方法首次研究了水动力作用下的亚细胞和细胞器结构。解码后的图像几乎衍射受限，即使有效曝光时间可以超过传统运动模糊限制曝光的50倍。通过使用编码的激发序列，该系统可以成像快速移动的细胞，其空间分辨率与成像静止细胞中的荧光时所获得的分辨率相当。

图像采集过程分为两个步骤，包括物理编码和工程运动模糊的计算解码。他们研究了一种计算方法来消除运动模糊，而不是物理上最小化运动模糊。基于成像过程是线性和平移不变的假设，运动模糊可以通过反褶积去除。为了实现基于工程运动模糊的荧光成像平台，Schonbrun开发了如图1所示的系统。激发激光器的波长为488 nm，光功率为50 mW，聚焦到160µm的全宽半最大光斑?微流控装置内部的尺寸。相机是一个安多Neo科学CMOS相机操作在全球快门模式。激发光的物理编码由一个定制的斩波轮执行，该斩波轮用一个由18个脉冲组成的伪随机序列的时间代码调制荧光激发。两个编码序列产生的每一个旋转的斩波轮。当斩波器以100赫兹旋转时，每个脉冲是30µs长，产生540µs的总有效曝光时间，代码有?960µs总持续时间。假设空间分辨率为1 μ m，单个脉冲的运动模糊限制速度为33 mm/s。 Cells flow through a microfluidic channel that is 30 µm wide and 8 µm deep. While velocity may vary from cell to cell, due to laminar flow in the microfluidic channel, the velocity of an individual cell stays constant during illumination and the trajectory follows the fluid streamlines.

为了探索使用编码激励的图像重建，荧光珠通过微流控通道进行成像。图2显示了在四种逐渐降低的激发强度下2微米珠子的原始和解码图像。在所有四种情况下，珠以大约30mm /s的速度从左向右移动。该代码调制什么，否则将是一个平坦的模糊条纹，大约30微米的长度。从图2(e)可以看出，即使信噪比低于1，也能以合理的保真度重建图像。代码序列如图2(a)所示，以单个脉冲开始。因为这个脉冲通过后面的两个零与代码的其余部分隔离，运动模糊图像的开始部分可以用来表示单个脉冲曝光。运动模糊图像的这个区域用虚线表示。我们发现，对于所有四种激发强度，重建的信噪比大约是单脉冲的10倍。这种增强可以由较长的物理曝光和反褶积滤波器的噪声抑制相结合来解释。 While there is a trade-off between spatial resolution and background noise suppression in the implementation of the deconvolution filter, the longer effective exposure time enabled by the coded exposure increases signal strength without this trade-off. Schonbrun further extended this imaging approach to fluorescently labeled cellular organelles and found that it was possible to observe the relative location and morphology of these organelles in fast moving fluids. Motion-blur was effectively removed in this experiment, and intensity variations inside the nucleus were clearly resolved.

荧光成像的细胞流动可以实现基于图像的细胞分选和高通量显微镜表征的极其大量的细胞。此外，非粘附细胞可以在类似于血流的条件下成像，其中已知流体动力在细胞形态和功能中起着重要作用。除此之外，该方法还可用于研究血液和癌细胞在类似脉管系统的条件下的动力学。

使用时间编码激发的流动细胞的荧光成像;光学表达;2013年2月;第二十一卷第四期伊森·勋布伦，赛希瓦·戈提，黛安·沙克

流动细胞成像的Andor解决方案

由于在这个特殊的应用程序中细胞的快速移动，Neo和Zyla 5.5的全局快门模式是必需的。当使用卷帘快门模式时，Schonbrun注意到细胞的形状被扭曲了。Neo 5.5和Zyla 5.5配备了550万像素的传感器，在不影响读取噪声或帧率的情况下，提供了大视场和高分辨率。6.5微米的小像素尺寸确保了点扩散函数的足够过采样，即使对于低放大倍率的目标(例如10x NA 0.3;20x NA 0.5)。即使与性能最高的慢速读出ccd相比，读取噪声也非常低。Neo 5.5和Zyla 5.5可以实现低至1 e的读取噪声，无需信号放大，而Neo 5.5和Zyla 5.5分别以每秒30帧和100帧的速度读取550万像素，从而促进了动态事件的获取，如快速移动细胞的成像。