多色直接风暴与EMCCD摄像技术

Lampe等人开发了一种新的直接STORM (dSTORM)变体，称为光谱分解dSTORM (SD-dSTORM)，它结合了红色发射碳菁染料的光化学优势和光谱分解的原理。具体来说，他们使用了一种新型的碳菁染料组合Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 700来实现超分辨率，这两种染料都显示出单分子定位所需的出色的缓冲兼容闪烁特性。与其他超分辨率技术相比，SD-dSTORM需要更低的激光功率和更少的成像帧，以实现线性和点状生物纳米结构的超分辨率重建。

在目前可用的有机光开关中，碳菁染料Cy5和Alexa 647是单分子定位效率最高的。这是基于它们的光稳定性(每个on周期可达6000个光子)，最重要的是，它们在还原环境中表现出长时间关闭状态的能力。Lampe等人想要使用Alexa 647，需要找到一种荧光搭档，既能兼容缓冲区，又能表现出长时间的OFF状态。Alexa 700被选为候选人。结果表明，当β-巯基乙胺(MEA)和氧清除剂作用于100 ~ 300 mM时，以及在643 nm激发时，Alexa 700表现出延长的OFF状态。为了区分Alexa 647和700的重叠发射光谱，使用了Cairn Research公司的双通道发射分光器Optosplit II。发射波长通过一个二向色镜(710 DCXR)和两个发射滤波器(HC 687 / 40和ET 794 / 160)分割为短波长和长波长发射，并在Andor的iXon 897 EMCCD上并排检测。每个通道的二向色和带通发射滤波器与单激光线(643 nm)和发射光谱相匹配，以优化光谱分解所需的串扰。

为了评估Alexa 647和Alexa 700的光谱分离质量，在BS-C-1细胞中分别用市买到的每种颜色的二抗标记微管，并安装在dSTORM缓冲液(MEA, O2清除剂缓冲液)中。采集前，用3 - 5千瓦/厘米的光照样品²在643 nm处驱动荧光团进入OFF状态，直到微管结构溶解，观察到染料的随机闪烁。通常情况下，在相同激励下连续运行的EMCCD可以获得5,000 - 20,000帧。采集后，利用开源软件rapidSTORM确定整个双通道视图上的单分子定位及其单个强度值。Lampe等人使用他们自己的自定义算法来获得完全重建的双色SD-dSTORM图像。

图1。微管的SD-dSTROM重建。微管分别用Alexa 647(红色)或700(绿色)染色，并用SD-dSTORM成像。Alexa 647(红色)和Alexa 700(绿色)的定位强度值在2D强度直方图中显示了不同的种群。基于强度的颜色分配过滤器丢弃了串扰区域(灰色)的局部化。

为了确定双色SD-dSTORM系统的实验光学分辨率，对SD-dSTORM中单分子定位的散射进行了成像(图1)。从这一分析中，定位簇表现为完全独立的点，表明通道之间的串音概率很低。两个通道的分辨率(Alexa 647为22 nm, Alexa 700为30 nm)与之前报道的使用Alexa 647作为荧光团进行定位显微镜的分辨率值非常相似。

SD-dSTORM在细胞生物学中的适用性通过对亚细胞物体的成像得到了证明，这些物体已知具有不同的形状和空间定位，使用Alexa 647和Alexa 700标记的不同二抗。选择灶性粘连，细胞周围的大蛋白复合物，网格蛋白包被的凹坑，质膜上约150nm大小的水泡状物体。两者都不与彼此或与微管共定位，因此应该作为单独的亚细胞结构出现。双色SD-dSTORM显示分离良好的超分辨微管和局灶性粘连(图2A)和分离良好的微管和网格蛋白包被的凹坑(图2C)。作为对照，用Alexa 647和Alexa 700标记微管，以显示两个通道的共定位(图2B)。

图2。SD-dSTORM分离和共定位结构的重建。用Alexa 647染色的微管的SD-dSTORM(红色)和用Alexa 700染色的局部粘连(A)或网格蛋白重链(C)或微管(B，用于共定位测试)(绿色)。比例尺= 1 μm。

Lampe等人在用户友好的多色单分子超分辨率显微镜方面取得了重大进展;它结合了红发碳菁染料的优点和光谱分离原理，实现高效、可靠、快速的多色dSTORM。在光谱分解的基础上，SDdSTORM提供了使用其他相关红色染料(即Alexa 750)扩展到两种以上颜色的可能性。SD-dSTORM可以与任何商业上可用的本地化软件(即QuickPALM和rapidSTORM)相结合。如果结合标签技术，SD-dSTORM有望成为活细胞成像的优势。

在Jan Schmoranzer和Andre Lampe的实验室中，多色直接STORM的设置显示了iXon3 897和OptoSplit II。

研究论文:多色直接风暴与红色碳氰基发射，细胞生物学(2012)，DOI: 10.1111/boc.201100011。