蛋白质折叠和展开机制的显微研究

结合TIRFM和AFM

Atom Sarkar博士现在是俄亥俄州立大学医学中心(俄亥俄州哥伦布市)的神经外科医生，他与哥伦比亚大学(纽约州纽约)的Julio Ferdandez教授合作，一直对纳米技术在神经外科中的作用感兴趣。目前，他正在深入研究蛋白质力学。为什么?因为了解蛋白质的结构动力学对于理解从脑肿瘤到阿尔茨海默病等神经退行性疾病的许多神经疾病至关重要。蛋白质的折叠和展开发生在纳米尺度上。因此Atom需要一种纳米或亚纳米分辨率的技术。共焦不能解决问题。他一直在使用定制的全内反射(TIRF)/原子力显微镜(AFM)/电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)来研究蛋白质的展开，目的是开发一种只使用tirf的方法来跟踪亚纳米分辨率的蛋白质动力学。这将为更多的科学家打开蛋白质展开实验的大门。

一系列瞬变渗透深度的测量

该方法背后的关键原理是使用纳米级校准的倏逝波来测量沿光轴移动的荧光团的位置。通过使用TIRFM产生的倏逝波，其强度随垂直距离的函数呈指数衰减，Atom可以将荧光强度的变化与垂直轴上的位移相关联。为了校准倏逝波，AFM/TIRFM/EMCCD装置由一个AFM头安装在TIRFM显微镜上，并配有电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)(见TIRFM和AFM组合图)。该系统利用距离相关的倏逝波作为“尺子”，将荧光强度反卷积为长度(见上图)。

上面描绘的六条曲线很好地说明了测量到的倏逝场衰减，以及如何通过改变TIRFM条件，可以调整倏逝波穿透深度dp以适应实验需要。用消失场测量距离的能力被称为消失纳米测量。

消失纳米技术已经被用于跟踪蛋白质泛素的被迫介导的展开，这些结果可以与标准AFM研究得到的精度和准确性相媲美。

目前的实验包括完全取代AFM，并将磁性荧光珠附着在蛋白质上。

磁珠允许通过电磁镊子设置来操纵被栓住的蛋白质，而磁珠的荧光可以实现对蛋白质展开和折叠动态的纳米级精确监测，这是由EMCCD捕获的。