活线虫的单分子成像-显微镜

近年来，单分子荧光显微镜技术已被应用于培养细胞中生物分子的研究。将这些技术扩展到活体动物成像，可以开辟新的途径来检查活组织内稳态控制下信号分子的纳米级行为，以及在各种发育或致病阶段。在完整的成年动物中进行SM荧光成像仍然具有很大的挑战性，尽管以前曾在斑马鱼和秀丽隐杆线虫的胚胎和早期幼虫阶段跟踪个体生物分子。虽然高对比度成像技术，如高倾斜和叠层光学片激发(HILO)或选择性平面照明显微镜已成功用于SM体内成像;针对特定部位的SM成像仍然需要先进的标记方法。

图1所示。活蠕虫dCALM共聚焦成像激活cd4分裂GFP在体壁肌肉表面。比例尺:100mm

南加州大学的Fabien Pinaud和他的研究团队首次在活体成年动物的单分子水平上对荧光生物分子进行成像。利用远场荧光显微镜和CALM，在完整的活秀丽隐杆线虫的封闭组织区域内实现了膜蛋白的高度特异性、SM灵敏度和纳米精度成像。CALM应用于活体成体秀丽隐杆线虫(C. elegans)中CD4和电压依赖性Ca2+通道(VDCC)膜蛋白的组织特异性成像和SM跟踪。他们的结果表明，CALM的SM成像和跟踪可以直接在完整的动物中以亚分辨率精度对肌肉营养不良等疾病进行显型。

CALM是一种SM技术，允许在微摩尔浓度的荧光探针下对活细胞中的单个生物分子进行纳米精确成像，而不依赖于它们的表达水平，并且不需要清洗多余的探针。在CALM中，感兴趣的蛋白质被融合到一个缺乏16个氨基酸β链的黑色、未成熟的分裂gfp上。然后，通过不可逆的结合和与编码缺失GFP b链的合成肽序列(M3肽)互补，它们被荧光激活。微量注射这些M3多肽可以在动物体内扩散。它们可以通过靶向和不可逆地结合细胞表面分裂- gfp融合蛋白来激活工程肌肉和神经元组织中的荧光信号。通过调整注射的M3肽的浓度，通过直接检测激活的split-GFP, dCALM(图1)或SM-CALM- spfret(图2)，无论蛋白表达水平和肽非特异性结合，都可以使用靶向近红外荧光团进行集成或连续SM CALM成像。

采用488nm HILO激发进行SM dCALM成像。在这些条件下，激活的CD4-split-GFP可以通过点扩散函数的二维高斯拟合来跟踪，平均定位精度为32±8 nm(图3)。在微注射M3-A647多肽后，用SM CALM-spFRET对蠕虫进行成像。在肌膜处，个别互补的cd4 -分裂-GFP被鉴定为衍射受限和共定位的扩散点，当在488nm激发时，它们在GFP和A647检测通道中发射。GFP和A647荧光信号消失的单个漂白步骤和闪烁事件表明，CD4-split-GFP和M3-A647之间存在有效的分子内spFRET，并向Pinauds研究团队证实了他们在线虫中特异性靶向、激活、检测和跟踪单个跨膜CD4-split-GFP的能力。

最近有人提出，在肌营养不良蛋白突变体秀丽隐杆线虫中VDCC活性的失调是肌营养不良发生的关键因素;然而，通道的位置和膜动力学还没有在活体动物中进行研究。Pinaud和他的研究团队使用SM dCALM和HILO激发，对正常和营养不良蛋白突变的秀丽隐杆线虫的肌肉细胞肌膜和神经肌肉突触内的单个VDCC进行了成像和跟踪。他们的研究表明，肌萎缩蛋白是一种承重元件，也是一种自适应张力传感器，参与调节VDCC在肌膜上的纳米级限制，以响应肌肉张力的变化。

参考文献

詹，等。体内单分子成像鉴定了抗肌萎缩蛋白突变秀丽隐杆线虫钙通道的动态变化。Nat. common . 5:4974 doi: 10.1038/ncomms5974(2014)。