随机光学重建显微镜

图1:哺乳动物细胞中线粒体的常规和STORM图像的比较。标记线粒体外膜蛋白Tom20。(左面板)细胞左侧的常规图像。(中间面板)细胞中部的3D STORM图像。z维信息根据色标条进行颜色编码。(右面板)。细胞右侧STORM图像的xy横截面。图片由哈佛大学化学与化学生物学系庄研究组提供。

经典光衍射施加的分辨率限制代表了获得活细胞结构有意义的见解的能力的主要限制。传统的光学显微镜工具只显示了直径约200纳米的结构。不幸的是，大多数参与细胞间通讯、细胞生长和分裂等生理过程的细胞器往往低于这一限制阈值。事实上，许多细胞骨架组件可以小于50纳米，如果直接进入纳米领域的光学途径易于获得，我们对其功能的理解将大大提高。

一种新型的3D超分辨率显微技术使人们有可能对以前无法解决的环境获得新的见解。庄实验室描述的3D随机光学重建显微镜(“STORM”)方法最近使团队能够以多色对整个细胞进行成像。使用多个光切换标签，固定哺乳动物细胞的整个线粒体网络已经被询问，阐明了在传统荧光图像中被掩盖的线粒体形态和微管相互作用。

STORM方法使用单个荧光团分子的连续成像，因为它们在亮和暗状态之间切换。通过激活激光脉冲仅激发单个标签的随机子集，可以获得单个分子的低光图像，可以识别为单个衍射有限点。这使得每个荧光分子的位置可以以纳米精度确定。这种脉冲的重复循环可以确定所有分子的位置，然后从这些精确确定的荧光团位置构建超分辨率图像。

初步获得横向分辨率20 ~ 30 nm的二维图像。通过引入一种“散光”成像方法，该方法产生两个略微不同的焦平面，通过分析荧光团图像的椭圆度和方向，可以确定分子的轴向位置，精度为50-60 nm，从而实现了对3D定位的扩展。

然而，纳米记录涉及到每帧成像有限数量的孤立分子。此外，短曝光时间和快速帧率对于在时间框架内获得必要的合成图像集至关重要，最终将使该技术可用于活细胞中的动态过程。

利用安多公司的电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)技术，在超分辨率方面取得了最新进展。在弱光条件下，由于此类实验的低信号/高噪声性质，图像采集是一项具有挑战性的任务，而安多高性能iXon Ultra 888 EMCCD摄像机的主要优势在于，即使在快速读取速度下，它也能够最大限度地降低相机噪声。特殊的功能，如“光学中心裁剪传感器模式”采集，结合最佳的读出电子，确保iXon Ultra 888也可以提供行业领先的帧速率。