处理自发荧光背景的红外染料

当一个实验的目的是成像单个分子时，自发荧光背景会阻碍它们的检测。在细胞中，对荧光背景的主要贡献来自细胞内的自体荧光。通常，消失场激发或全内反射荧光(TIRF)被用于减少背景，然而，这种方法将激发限制在几百纳米厚的薄层，并且无法跟踪分子内化或成像细胞内的细胞器。第二种方法是光谱涉及在光谱的近红外(NIR)区域激发荧光，其中由细胞自发荧光产生的背景要低得多。Stephen Webb博士和他在英国Didcot中央激光设施的研究团队研究了一系列商业上可用的有机近红外染料在相同条件下的亮度、光稳定性和闪烁特性，以期选择最适合细胞单分子成像的染料。

图1。MCF-7细胞的自身荧光背景和单个近红外分子。a .单个区域的未标记MCF-7细胞，分别用宽波段780 nm、695 nm和545 nm光照，图像显示随着激发波长的增加，自身荧光背景减少。白光透射图像表明细胞在视场内的位置。B.转铁蛋白- irdye 700DX和转铁蛋白- irdye 800CW单分子在MCF-7细胞上的图像，同时用宽频780 nm和695 nm光照射。红色和蓝色圆圈突出显示的分子的典型强度和时间痕迹显示在右侧。

与近红外成像兼容的染料，可以在695 nm或780 nm激发，MCF-7细胞是一种常用的乳腺癌细胞系，在可见光波长的光照射下产生明显的自发荧光背景，被选择用于研究。

在选择用于单分子成像的染料时，获得足够的信号是至关重要的，因此Webb博士和他的团队选择了基于初始集成荧光研究的四种最亮的近红外染料。所选染料为Alexa 700和IRDye 700DX(激发波长为695 nm)， Alexa 790和IRDye 800CW(激发波长为700 nm)。研究了每种染料分子的单分子强度、光漂白速率和闪烁特性。本研究结果表明，虽然Alexa 700和IRDye 700DX之间的差异很小，但两种IRDye的平均强度都优于相应的Alexa染料。在光漂白方面，IRDye 700DX的光稳定性高于Alexa 700，而IRDye 800CW和Alexa 790表现出相似的光漂白动力学。

为了研究闪烁对测量光漂白动力学的贡献，从相同的数据集中产生了荧光发射周期的直方图。将单个指数衰减曲线拟合到这些直方图上，以获得每种染料在进入暗态之前连续发射的平均时间(“准时”)。每个分子的占空比定义为总发射周期除以最后漂白事件发生时经过的时间。Alexa 700的平均“按时”时间不到1秒，占空比为0.62，即Alexa 700强度痕迹包括持续数秒的短荧光爆发。相比之下，IRDye 700DX的平均“准点率”为1.4秒，占空比更高，这表明染料的发射时间更长，偶尔会出现短暂的暗状态。在波长较长的染料中，IRDye 800CW比Alexa 790具有稍长的“准点率”和更大的占空比。

通过在MCF-7细胞中成像进一步测试了所研究的四种近红外染料。最初未标记的MCF-7细胞成像，随着波长的增加，观察到自身荧光背景的减少。当细胞在780 nm激发时，几乎没有观察到高于探测器噪声的背景(图1 A)。用转铁蛋白- irdye 700DX和转移- ir Dye 800CW标记细胞表明，在epi和TIRF照明下，总背景强度随着波长的增加而降低(图1 B)。发现IRDye 700DX不够亮，无法进行外显荧光照明，但IRDye 800CW在这种模式下成像时保持了足够的信本比。

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