分子机制在行动-高分辨率时移成像活细胞

旋转圆盘共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用

这莱顿大学医学中心细胞与化学生物科(CCB-LUMC)目的是解开细胞功能的分子基石，并了解它们在疾病中的扰动。最终的长期目标是将新兴的知识和技术转化为临床实践。为了适应这一任务，研究范围从细胞生物学过程的基本理解到复杂细胞系统(如器官和组织)的化学操作，为疾病干预铺平了道路。这项研究涉及生命科学的多个学科:病毒和膜生物学、化疗药物的细胞生物学、致癌信号、糖尿病中的抗原呈递等。

选择相关的研究方法行动中的分子机制是活细胞成像使用共焦显微镜．这安德龙蜻蜓旋转盘共聚焦广泛用于石英细胞和化学生物部门的各种研究项目。CCB部门使用时间流逝显微镜了解细胞生物学过程和细胞、细胞器和分子的时空行为，从而提供相对于固定样品多得多的信息。

的使用CRISPR-mediated敲入技术，这迅速成为标准实践，协同促进共焦时间流逝成像，以允许观察活细胞中的内源性荧光标记的蛋白质。然而，由于敲入（s）在内源性启动子的控制下，它们的表达水平通常是低的，特别是与异位（上） - 表达水平相比。因此，CRISPR敲入 - IN（S）分析要求提供极其灵敏的检测的显微镜。

此外，研究细胞细胞行为和研究有丝分裂细胞遇到与迭代获取速度和光毒性相关的其他技术挑战。

“Andor Dragonfly为我们提供了在不影响采集速度的情况下解决灵敏度和光毒性问题的解决方案。”

莱纳德·沃特曼博士，莱顿大学医学中心细胞和化学生物学系

图1 - 莱顿大学医疗中心的光学显微镜工具的Andor Dragonfly 500

细胞与化学生物学系的研究项目（LUMC）

在本节中，我们概述了来自实验室的几个研究项目Jacques教授Neefjes.和Huib Ovaa教授在CCB-LUMC。这些项目不同于细胞生物学的基本机制到转化研究，采用现代显微镜和分子生物学技术使用蜻蜓纺丝盘显微镜。（有关蜻蜓旋转磁盘的概述，请阅读布朗姆，2017年的）

项目1)-如何调节细胞内运动以支持细胞器功能?

细胞器在细胞空间内运动的复杂性与它们的功能状态密切相关。运动细胞器(线粒体、核内体、溶酶体和自噬体)和感染因子(包括细菌和病毒)沿着微管移动。这个运动以一种双向的走走停停的方式完成，由运动蛋白和动力蛋白运动蛋白驱动。

若干生物学问题仍未得到答复：

• 这种双向运动到底需要什么?
• 如何调节双向运动以支持细胞器功能?

为了回答这些问题Neefjes实验室在监测双向运动途径的不同潜在部件的几个双色敲击电池中进行了几种双色敲击细胞。敲击的实例包括内源性电动机（KIF5和Dynein）或晚期内体效应蛋白（RILP和FYCO1）。晚期内体蛋白在众所周知的小GTPAseRab7下游作用。使用的另一种工具是细胞系是标记的所有囊泡;这种细胞系的使用将允许分析细胞中囊泡的“拥挤”。

本研究项目的成像将使用延时显微实验的活细胞其次是广泛的图像分析．该工作的最终目标是了解细胞生物学中双向细胞石运输的基础。（以例见图2）

在类似的研究中，设计用于特异性靶向脱硫酶USP32的化学抑制剂与细胞系相结合，以化学扰动细胞内输送途径。Deubiquitylating酶USP32调节Rab7功能（Sapmaz＆Berlin等，2019）。

总之，使用各种化学生物学工具Ovaa实验室， Neefjes实验室将继续剖析胞内细胞器的双向运动机制。要推进这个项目，需要广泛的活体成像显微镜。

图2 -具有代表性的蜻蜓500双向运动和细胞器动力学共聚焦图像。表达mCherry-Rab7或其突变体的活HeLa细胞与Arl8b-GFP (绿色），在时间流逝开始（T_0.)．右图：在延迟持续50帧时持续时间间隔持续50秒的轨道，其次呈现ARL8B阳性囊泡。在蜻蜓500上收集时间流失，使用斐济的轨迹进行囊泡跟踪。图像改编自Jongsma，Bakker等，Embo Journal 2020

项目2） - 内质网架构如何调制？

内质网(ER)是细胞内的中央腔室，它可以与细胞内的每一个细胞器相互作用。内质网是一种复杂的生物合成细胞器，它也分泌乙二醇脂类和离子，并将钙信号和代谢信息转导给其他细胞器。为了区分和促进这些不同的功能，ER拥有密集的核周部分和更管状的外周网络。

这项研究的结果已发表于欧洲教育管理办公室报告(Spits等人。，2021的）用旋转圆盘共聚焦显微镜观察了近50部影片蜻蜓纺丝盘显微镜．

项目3)-了解细胞分裂过程中细胞器的组织和运动。

核内体提供对成功的细胞质分裂和脱落至关重要的膜和蛋白质成分。Neefjes实验室最近发现了一种er嵌入的泛素连接酶，它控制着内溶酶体途径的核周位置（Jongsma＆Berlin等，2016）。这种定位的控制是有效和及时的货物交换的关键因素。然而，我们期望在有丝分裂中，这种嵌入式组织（即，ER和内体之间的相互作用可能会丧失，以促进细胞因子和子溶解体系统对新生女儿细胞的分布。

为了进一步了解有丝分裂期间的肌动血剂（和其他细胞器）的时空组织 - 以及on theOupon的效果 - 基因组编辑技术将与纺丝盘显微镜结合使用，实时地遵循荧光有丝分裂细胞。研究人员 - Ilana Berlin和Lennard Voortman-添加“该企业将需要广泛的显微延时成像，这是蜻蜓共聚焦的关键应用”。

参考书目

• 布朗,（2017）你的下一个共聚焦应该是蜻蜓的十二个理由．
• Sapmaz＆Berlin.et al .,（2019）USP32通过Rab7去泛素化调控晚期内体运输和循环自然通信v10 pg 1454.
• Spits et al.， (2021)可移动的晚期核内体调节外周内质网网络结构Embo报告e20815
• Jongsma＆Berlin等，（2016）ER相关的途径定义受控货物的内陷架构运输细胞v166 pg 152
• Jongsma，Bakker等，（2020）Skip-Hops为RAB7到ARL8B标识开关招募TBC1D15以控制晚期内部运输EMBO期刊v39 e 102301