利用光遗传学研究特定神经元的功能。

科学家可以了解网络中特定神经元的功能，比如使用结合天然或合成光开关的蛋白质来了解大脑。光可以打开或关闭这些光开关，从而控制特定细胞的活动，从而观察特定神经元种群如何改变处理和行为。

神经元中的过程发生得很快，所以速度对一些研究来说是至关重要的。细菌视紫红质和HaloR家族是仅有的具有毫秒分辨率的光激活抑制蛋白。然而，它们并非没有改进的空间。两者都需要持续的光照来保持激活，持续的光照会导致诸如反弹激发或最终部分失活等问题。此外，HaloR需要较高的光强度，因为电流的大小是由泵注循环的持续激活所驱动的。

图1。一种离子型谷氨酸受体(左上)和一种合成光开关，称为马来酰亚胺偶氮苯-谷氨酸(MAG;下)是光控HyLighter离子通道(右)的基础。图片由Harald Janovjak博士提供。

因此，由加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的Ehud Y. Isacoff领导的研究人员设计了一种配体门控离子通道，该通道具有K+选择性，并由光控制。这种离子通道被称为HyLighter，在暴露在光线下之前是不活跃的，它比HaloR对光线更敏感，并且可以在很宽的光强度范围内达到最大电流。

光激活离子通道可以将光脉冲转换为稳定的超极化电流，在没有照明的情况下保持通电，直到使用互补波长关闭。它是基于离子型谷氨酸受体(iGluR)。这些阳离子通道在高等生物中介导兴奋性神经传递，与Na+和K+有关。

图2。覆盖共聚焦堆叠的MIP图像HyLighter:GFP与非特异性tdtomato。注意细胞显示广泛的(黄色)存在HyLighter GFP，当用390nm脉冲照射时，它可以用来沉默神经元。500nm脉冲照明灭活K+通道。

为了创建HyLighter，研究人员首先设计了具有iGluR6配体结合域的嵌合iGluRs, iGluR6是一种在兴奋性LiGluR通道中编码光敏感性的光开关系结配体附着位点，sGluR0是一种外来细菌iGluR同源物。他们对自己创造的各种嵌合体进行了实验，发现其中一种具有所需的所有特征。它的功能是一个光门控K+通道，在波长~390 nm的低光强度下最大限度地激活，在黑暗中保持活性，在500 nm的光下可以关闭。

他们通过生物基因转移将hylight - gfp转染出生后早期大鼠的培养海马切片来测试hylight。海马各区域表达良好，神经元各部位分布均匀。他们用连接到显微镜的Lambda DG-4光源的390 nm照明激活HyLighter，并通过马赛克DMD通过40X物镜投射到样品上。

图3。当hylight被390 nm光激活(紫色条)时，电流注入触发的动作电位会被抑制，而当hylight被500 nm光激活(绿色条)时，动作电位不再被抑制。

“在现有的显微镜解决方案中，只有马赛克允许您连续照亮成像领域中的任意掩模。激光扫描显微镜根本无法做到这一点，因为它永远无法提供真正的同步照明。这一重要功能结合易用性和与软件的直接接口，使Mosaic成为光遗传学社区独特而有价值的工具，”Harald Janovjak博士说，他是研究团队的一员，现在在奥地利科学技术研究所(IST奥地利)。

在海马体切片中，hylight诱导了强超极化，可以使神经元放电沉默，直到在500 nm光下失效。在样品中，390 nm处的光强约为20 mW mm-2, 500 nm处的光强约为40 mW mm-2。

研究人员还培育了表达hylight的转基因斑马鱼。当这些鱼的尾巴受到390纳米的刺激时，机械刺激后逃跑反应的概率降低了。在500 nm的光照下，这一结果正好相反。光照对不表达HyLighter的斑马鱼的逃跑反应没有影响。

研究人员期待HyLighter成为光遗传控制神经元活动的重要工具。Janovjak博士说:“当涉及到神经细胞的沉默时，双稳定性和对少量光线的要求使HyLighter独一无二。”

设备清单

• 奥林巴斯IX70电生理学
• Zeiss AxioExaminer用于成像
• Axopatch和P-Clamp (Molecular Devices Inc.)用于膜片钳电压记录
• 马赛克DMD和针对神经元放电抑制的软件
• 萨特DG4P光源用于镶嵌照明
• CSU激光旋转盘用于获取神经元共聚焦图像