利用特定神经元的光学抑制来解开大脑的复杂性

科学家可以了解复杂网络中特定神经元的功能，比如大脑中使用的蛋白质充当“光开关”。光遗传学在神经科学中被证明非常有效比以前的电刺激方法更精确。光可以以高度可控的方式打开和关闭光开关，从而能够精确控制特定细胞的活动，从而可以观察电路和更广泛组织中定义的神经元种群如何改变处理和行为。

一类快速光开关hylight的研制

神经元中的过程发生得很快，所以速度是许多研究的关键参数。细菌视紫红质和HaloR家族是光激活抑制蛋白，允许毫秒分辨率。它们已经并将继续非常有用，但并不是没有改进的空间。两者都需要持续的光照来保持激活，持续的光照会导致其他问题，如反弹激发，或最终部分失活。此外，HaloR需要较高的光强度，因为电流的大小是由泵注循环的持续激活所驱动的。

因此，由加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的Ehud Y. Isacoff领导的研究人员设计了一种配体门控离子通道，该通道具有K+选择性，并由光控制。这种离子通道被称为HyLighter，在暴露在光线下之前是不活跃的，它比HaloR对光线更敏感，并且可以在很宽的光强度范围内达到最大电流。

光激活离子通道可以将光脉冲转换为稳定的超极化电流，在没有照明的情况下保持通电，直到使用互补波长关闭。它是基于离子型谷氨酸受体(iGluR)。这些阳离子通道在高等生物中介导兴奋性神经传递，与Na+和K+都有关。

为了创建HyLighter，研究人员首先设计了具有iGluR6配体结合域的嵌合iGluRs, iGluR6是一种在兴奋性LiGluR通道中编码光敏感性的光开关系结配体附着位点，sGluR0是一种外来细菌iGluR同源物。他们对自己创造的各种嵌合体进行了实验，发现其中一种具有所需的所有特征。它的功能是一个光门控K+通道，在波长~390 nm的低光强度下最大限度地激活，在黑暗中保持活性，在500 nm的光下可以关闭。

图1。一种离子型谷氨酸受体(左上)和一种合成光开关，称为马来酰亚胺偶氮苯-谷氨酸(MAG;下)是光控HyLighter离子通道(右)的基础。图片由Harald Janovjak博士提供。

他们通过生物基因转移将hylight - gfp转染出生后早期大鼠的培养海马切片来测试hylight。海马各区域表达良好，神经元各部位分布均匀。他们用连接到显微镜的Lambda DG-4光源的390 nm照明激活HyLighter，并通过显微镜将其投射到样品上马赛克通过一个40倍的目标。

“在现有的显微镜解决方案中，只有马赛克允许您连续照亮成像领域中的任意掩模。激光扫描显微镜根本无法做到这一点，因为它永远无法提供真正的同步照明。这一重要功能加上易于使用和与软件的直接接口，使Mosaic成为光遗传学社区独特而有价值的工具。”Harald Janovjak博士说，他是研究团队的一员(现在在莫纳什大学的澳大利亚再生医学研究所)。

在海马体切片中，hylight诱导了强超极化，可以使神经元放电沉默，直到在500 nm光下失效。在样品处，光强约为20mw mm^－2在390纳米和40毫瓦毫米^－2在500纳米处。

图2。覆盖共聚焦堆叠的MIP图像HyLighter:GFP与非特异性tdtomato。注意细胞显示广泛的(黄色)存在HyLighter GFP，当用390nm脉冲照射时，它可以用来沉默神经元。500nm脉冲照明灭活K+通道。

图3。当hylight被390 nm光激活(紫色条)时，电流注入触发的动作电位会被抑制，而当hylight被500 nm光激活(绿色条)时，动作电位不再被抑制。

转基因斑马鱼2波长设计的研究

研究人员还生成了表达hylight的转基因斑马鱼模型。当这些鱼的尾巴受到390纳米的刺激时，机械刺激后逃跑反应的概率降低了。在500 nm的光照下，这一结果正好相反。光照对不表达HyLighter的斑马鱼的逃跑反应没有影响。研究人员说，作为一种新的光激活的纯超极化离子通道，HyLighter补充了现有的光遗传学工具。它的推挽双波长设计、低光要求和独特的光谱灵敏度使其成为一种有效的方法，可以在时间精度上抑制完整神经回路中特定细胞的活动。此外，双波长设计意味着它可以用于实验中，在光照后神经元沉默，然后在环境光或黑暗中进行行为分析，没有视觉刺激影响结果。

“当涉及到神经细胞的沉默，双稳定性和小的要求大量的光使HyLighter独一无二。”贾诺贾克博士说。

HyLighter和其他天然的和合成的光学荧光蛋白随后帮助解决了神经生物学中的许多关键问题。

感谢莫纳什大学澳大利亚再生医学研究所的Harald Janovjak博士和加州大学伯克利分校的Ehud Isacoff博士。

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• 光门控，钾选择性谷氨酸受体对神经元放电的光学抑制，Janovjak H.， Szobota S.， Wyart C.， Trauner D.， Isacoff EY。自然神经科学13,1027-1032 (2010)https://doi.org/10.1038/nn.2589
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