利用激光消融研究细胞分裂过程中细胞骨架的作用

细胞的组织对其功能至关重要，了解组织如何影响功能是细胞生物学的主要目标。其中一个基本问题是细胞如何利用细胞骨架将空间信息整合到细胞周期调节中。一项值得注意的研究是由约翰·a·库珀教授(华盛顿大学生物化学和分子生物物理学系主任)和纽约奥尔巴尼沃兹沃斯中心的阿列克谢·霍德贾科夫博士领导的研究小组进行的，他们在细胞周期中使用微管消融技术对细胞的各种成分进行消融。

酵母:发育研究的模型

出芽酵母细胞是其中一种常见模式生物用于研究细胞分裂。在出芽酵母的分裂过程中，酿酒酵母，有丝分裂纺锤体的一端穿过芽颈，将基因组传递给子细胞。纺锤极体突出的细胞质微管通过与细胞皮层相互作用，使纺锤体沿母芽轴定向，然后将纺锤极体穿过颈部进入芽内，从而完成这一过程。

检查点机制作为细胞分裂的质量控制

细胞有质量控制机制，以防这个过程出错。例如，突变会导致纺锤体运动的延迟。在这种情况下，有丝分裂在母细胞中进行，但如果事情没有在后期自我纠正，一种称为纺锤体位置检查点的细胞周期检查点机制将停止有丝分裂。科学家们对这个检查点是如何阻止有丝分裂有一定的了解，但还不完全清楚检查点机制是如何检测到纺锤体不在正确的位置继续进行的。先前的研究表明，当有丝分裂纺锤体没有充分地位于新生母细胞和子细胞之间时，分裂酵母会阻止细胞周期的进展。这意味着细胞必须监控纺锤体的位置，并解释它相对于其他一些位置，如地标。

利用激光消融中断有丝分裂纺锤体

为了验证从纺锤体延伸到芽颈的细胞质微管对这一过程很重要的假设，Cooper的团队使用激光消融中断了微管与芽颈的相互作用。研究人员使用了一种微点脉冲激光系统将其发射调至539 nm，对动力蛋白突变芽殖酵母细胞中的GFPlabeled微管进行激光显微手术。这些动力蛋白突变体不能将纺锤体拉过芽颈，因此纺锤体位置检查点阻止了有丝分裂。

通常MicroPoint系统用于光遗传学实验，作为一种向显微镜添加光漂白/光激活模块的方式，但系统激光的可调性也提供了灵活性，可以将系统用于消融，就像本实验中对微管所做的那样。MicroPoint允许用户在激光消融过程中对标本进行成像，这使得研究人员可以直观地瞄准动态微管进行消融。微管在细胞中快速移动，因此能够观察整个细胞的消融对于灵活定位和随后验证微管切断是至关重要的。

在使用539纳米光脉冲切断芽颈和纺锤极体之间的单个细胞质微管后，研究人员观察到剩余微管的远端片段发生了位移。片段和剩余的微管被解聚，几分钟后又生长回来。他们对这些细胞的纺锤体进行了长达90分钟的监测，以观察细胞在后期是否仍然处于停滞状态。为了成像，他们使用100倍，1.35 N.A.油物镜的倒置荧光显微镜，488 nm激光激发的自旋盘共聚焦和一个超声显微镜拍摄细胞的时间间隔Z系列EMCCD相机为检测。Z系列覆盖深度为3µm，时间序列以30或60 s为间隔捕获。

图1:消融前有丝分裂纺锤体，图2:消融后2秒，图3:消融后7秒，图4:消融后12秒，图5:消融后17秒，图6:消融后22秒。

阐明纺锤体位置和微管在细胞分裂中的作用

当芽颈部的细胞质微管被切除后，大部分细胞进行有丝分裂，这表明芽颈部的细胞质微管缺失激活了有丝分裂退出网络。接下来，研究人员进行了实验，以确定破坏不在颈部的细胞质微管是否会破坏检查点。在检查点激活的细胞中，微管从一个纺锤极体穿过颈部延伸，它们消融了另一个纺锤极体的微管(微管没有穿过颈部)。大多数细胞仍处于有丝分裂状态。最后，他们进行了破坏纺锤杆体或切断纺锤杆体附近微管的实验。这两种行为都没有促使有丝分裂退出。

“总的来说，这些消融实验表明，破坏从纺锤体延伸到芽颈的微管会导致细胞不能阻止细胞周期进程，从而退出有丝分裂。这表明细胞质微管对于读取细胞周期调控的纺锤体上游的位置很重要。”

这些发现对不同物种都有影响。在后生动物发育和成体组织内稳态的不对称细胞分裂过程中，它们对于基因组在细胞质适当区域的忠实分布可能特别重要。

感谢华盛顿大学的John A. Cooper教授和纽约州奥尔巴尼沃兹沃斯中心的Alexey Khodjakov博士

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