简短的传记笔记和采访Kazuaki Yoshioka博士，囊泡贩运专家

Kazuaki Yoshioka博士是日本金泽大学医学科学研究生院生理学系(Yoh Takuwa教授实验室)的专职研究员。

Kazuaki Yoshioka博士在东京农业科技大学松冈英明教授的实验室完成了他的博士学位。此外，他在美国生物分析系统公司(BASi)担任博士后研究员;随后，他又去东京都医学科学研究所申请了第二个博士后研究员职位。目前，Yoshioka博士的研究重点是囊泡运输领域。

Yoshioka博士的目标是了解PI3激酶在囊泡运输中的作用，以及它们在正常内稳态和疾病中的重要性。Yoshioka博士拥有出色的发表记录，从科学网络上被引用1862次的57篇论文中获得27个h指数。

在Yoshioka博士关于囊泡转运的有趣研究之后，我们想了解是什么推动了他的囊泡转运研究，以及他需要克服哪些挑战才能回答他的研究问题。在这里，我们提出了吉冈博士最近的挑战和发现的采访。

Q1:您为什么对研究囊泡感兴趣?

我们一直在研究II类磷酸肌醇3激酶(PI3K-C2α)在血管生物学中的生理基础。2012年，我们在《自然医学》上发表论文，发现PI3K-C2α是某些膜蛋白如VEGF(血管内皮生长因子)、S1P(鞘氨醇-1-磷酸)、TGFβ(转化生长因子-β)受体的内吞作用所必需的，从而调节血管屏障功能。因此，我们对PI3K-C2α调控内吞囊泡形成的分子和细胞机制非常感兴趣。

Q2。囊泡成像的主要挑战是什么?

我想尝试用多色(3-4种颜色)、高速(< 500ms - 1秒间隔)和高分辨率在活细胞中观察单个内吞事件。

我知道，TIRF显微镜是观察细胞表面内吞动力学的最佳选择之一。但我们需要通过早期/晚期核内体跟踪它们直到溶酶体。不幸的是，TIRF只能成像在薄的亚表层内吞作用的初始事件。

第三季。成像囊泡和回答您的研究问题需要什么分辨率?

我们需要高分辨率来观察网格蛋白包被囊泡(CCVs)。ccv的形成由许多因素组成，如动力蛋白、AP-2、肌动蛋白纤维、磷酸肌醇等。为了在内吞过程中区分这些分子，我需要获得50 -100nm分辨率的多色3D实时成像。

第四季度。为什么SRRF成像很重要?

因为SRRF结合蜻蜓(旋转盘)/iXon EMCCD的光毒性较低，可以较长时间地扩展传统的共聚焦显微技术，以z-堆栈成像多色通道。

Q5。你需要什么样的收购速度?

我们已经拍摄了活细胞的SRRF图像(2色，3 x z-stack)，间隔约10 - 15秒。

Q6。你们的样品经过光漂白吗?

并非如此。这比我想象的要好得多。我知道蜻蜓的优势，因为我一直是横河CSU + iXon的用户EMCCD系统。

问:正如你提到的，你看到光漂白水平很低，你认为这是因为你使用的是旋转磁盘系统吗?

是的。一般来说，旋转盘共聚焦系统不仅提供高速成像，而且由于激光暴露减少，显著降低了光毒性和光漂白。问题在于捕捉到的图像太暗。这个问题是克服了使用高灵敏度相机，如iXon EMCCD!

因此，我的意思是蜻蜓(以及横河CSU与iXon EMCCD耦合)实际上是低光漂白活细胞成像的最佳选择工具。

如果你比较旋转磁盘系统和点扫描器，有什么优点?

纺丝盘系统与传统点扫描系统相比，主要有两个优点:“速度快”和“光毒性和漂白性低”。

Q9样品在点扫描仪中漂白度高吗?那么在广域系统中呢?

是的，确实非常喜欢。我从不用这些系统做活细胞成像。

Q10。为什么你喜欢使用蜻蜓系统而不是你现有的CSU系统?蜻蜓有什么优势让你做出这个选择?

蜻蜓和CSU系统都是很好的活细胞成像系统。但是我们的横河系统(CSU10 + iXonEMCCD DV887)是一个旧的设置。我们深受其低分辨率和灵敏度之苦。蜻蜓帮我们解决了这些问题。最棒的是，蜻蜓可以简单地给我们超分辨率的图像。

问题11:TIRF和SRRF的结合对你的研究有好处吗?

是的，我希望我能。我意识到，使用蜻蜓的SRRF结合TIRF通道的实时成像将是对生命科学产生影响的最强大的系统。

12个。蜻蜓的哪些特性对您的研究最有帮助?

当我们试图确定细胞内兴趣的亚细胞定位时，蜻蜓允许我们使用连续高分辨率(共焦)宽视图模式和超分辨率(SRRF)放大视图模式进行多色(DAPI-， GFP-， RFP-和Far-red通道)3D成像。从实际经验来看，我可以说它有绝对不可思议的功能!

问题。在生成这些数据的过程中，有什么特别的时刻吗?

蜻蜓的表现给我留下了深刻的印象，它为我们提供了几乎完美的分辨率和速度平衡。蜻蜓可以应用于从单个活细胞到整个组织切片的各种生物样本。

Q14。你还有什么要补充的吗?

我爱蜻蜓．我为什么要用老式显微镜呢?

点击这里阅读我们的申请笔记吉冈Kazuaki研究工作。