升级你的显微镜

在这篇文章中，我们看看你有什么选择来恢复活力，甚至从你目前的显微镜中提取更多。自从你购买了你的显微镜，你可能已经改变了你的成像需求与新的研究项目-重要的是，成像技术也在进步。值得庆幸的是，有许多升级是简单的附加组件，但可以对现有显微镜获得的数据进行有用的改进。

充分利用现有的显微镜系统

在你更换你的显微镜的任何部件之前，你应该始终确保它的性能和它应该的一样好。由于长时间使用高强度光源(如金属卤化物灯)，过滤器滑块、轮子或立方体内的旧过滤器会随着时间的推移而恶化。您可以很容易地检查这些过滤器，看看涂层是否出现烧毁，或在照明内外区域之间有明显的差异。为了确保所有过滤器问题都被发现(因为有些可能不太明显)，我们建议由训练有素的服务工程师进行全面检查。请注意，维修技术人员将正确清洗易损坏的光学部件，并更换或建议更换任何已识别的磨损部件。仅凭这些步骤就能使老式显微镜恢复活力，使其恢复到以前的全部性能。一个干净的滤波器将允许您更好地检测由于性能较差而减少的信号。重要的是，具有更高效率涂层或更合适的带通的新型滤波器将允许来自样品的更好的信号水平，以及可能成像新的荧光色素。同样重要的是要考虑成像系统所使用的软件和PC。如果您可以更新到较新版本的图像采集软件，您可能会受益于已引入的新功能。 If you are running older versions of your Operating System, you may be prompted to update due to security concerns. Sometimes this may create issues with older devices no longer being supported, and prompt changes to your imaging system. Examples of Software and hardware upgrade include:

• 软件:多通道成像，光刺激集成，拼接，反褶积
• 硬件:新相机，光刺激装置，新光源，电动舞台

在本文的其余部分，我们将讨论特定显微镜升级的好处。

图1:即使是相对基本的显微镜也可以升级为新的相机、照明、更好的软件、光刺激、超分辨率或多通道成像等等。

如何升级并从你目前的显微镜得到更多

如果我们认为您的显微镜工作状态良好，并且更新了软件，那么我们就可以考虑如何进一步扩展您的显微镜的功能。

升级你的相机

将您的相机更新到新型号可能是提高任何显微镜整体性能的唯一最有效的方法。许多显微镜最初是作为整体包装的一部分出售的，其中包括一个基本的成像相机，可以很容易地与更高性能的型号进行交换。

新相机有以下好处:

• 提高灵敏度-新型科学相机的高量子效率(QE-将光子信号转换为电信号的效率)和低噪声，使您可以在更短的曝光时间内检测到更多样本，具有更高的清晰度和对比度。
• 更高的分辨率和更宽的视野-新的相机提供更多的像素和更大的传感器尺寸。这使得更宽的视野和更多的细节可以在图像中得到解决。
• 研究动态过程-随着更快的传感器速度和改进的灵敏度，您可以研究细胞的更快过程，这超出了原始成像相机的能力。
• 图像噪声小许多标准相机是“被动”冷却的。这允许一个紧凑的尺寸，但这意味着热噪声没有得到很好的调节，可以出现在一个高水平。这将导致图像“颗粒状”或噪声，以及图像中“热像素”的斑点。另一方面，科学成像相机主动将传感器冷却到不同的水平，以抑制热噪声，从而获得更清晰的图像。
• 不要遭受图像过度饱和或细节丢失的痛苦老式相机通常只能处理小范围的信号强度。实际上，这意味着很难捕捉图像中较暗和较亮的部分。像Andor Zyla这样的相机具有很宽的动态范围，从而可以在整个图像范围内保存细节。

增加光谱范围-一些现代传感器具有特定的涂层，可以更好地捕获UV和NIR(近红外)成像光谱两端的信号。这将意味着研究人员将提高灵敏度，甚至能够使用在光谱中更生物友好的区域发射的新型荧光染料进行成像。

图2:现代sCMOS camame4ra提供了更宽的视野，提高了灵敏度和更快的速度。(左)典型标准成像相机，(右)低噪声Andor sCMOS相机拍摄的相同图像。与许多显微镜最初提供的相机相比，相机升级可以做出重大改进。

你应该选择什么显微相机?

有了一系列可用的相机，与应用专家讨论这个问题是非常有帮助的。bob综合app官网登录他们可以帮助建议什么对您的成像需求是重要的，因为当面对许多不同的技术规格时，这可能并不清楚。然而，作为一般指南:

• 一般成像——一个sCMOS显微照相机如Zyla 4.2PLUS或Sona-6完全适合大多数活细胞和一般荧光成像应用。bob综合app官网登录这些相机提供高QE，低噪声和宽视场，适用于大多数显微镜。
• 发光-较长的曝光应用需要几秒到几分钟的曝bob综合app官网登录光将需要一个深冷CCD摄影机．这些相机提供的热噪声比流行的sCMOS相机的热噪声低几个数量级。像iKon-M这样的相机因此被用于植物或在活的有机体内发光实验。
• 单分子和弱信号——一个EMCCD相机如iXon Life 888是最弱信号的理想解决方案。在单分bob综合app官网登录子成像等应用中，这些相机仍然是首选的解决方案，因为它们能够在低于甚至是最新的背光sCMOS相机的信号水平下运行。技术的进步使得新一代EMCCD比旧一代EMCCD灵敏得多，传感器尺寸也更大。为了成像最微弱的信号，你应该考虑升级旧的EMCCD相机到一个更现代的EMCCD相机。请记住，当信号电平在sCMOS相机的可用范围内时，您可能会受益于sCMOS机型可能提供的更宽的视野和速度。

了解更多显微镜相机

用现代的替代品替换旧的照明

光源技术在过去十年中取得了长足的发展，特别是在宽视场荧光显微技术方面。如果您使用的是老式照明，如金属卤化物或汞灯用于荧光(或卤素用于透射照明)，升级到LED照明系统可以对数据质量、易用性甚至环境产生深远的好处:

• 有效的控制:led是固态的，可以通过手动模块、软件、TTL或模拟信号轻松控制。这包括许多参数，如简单的开/关开关和调制辐照度从0-100%。
• 活细胞成像:开关速度可以快至<7µs，并且能够安装内联激励滤波器，从而能够以闪电般的时间分辨率捕获动态事件(图3)。这是高速摄像机的理想补充。此外，简单地减少光照射的能力，因此减少光毒性提高活细胞分析的准确性。
• 预算自动化:将荧光显微镜转换为自动化成像系统，序列运行器功能是一个有用的特性，它克服了与高速TTL控制相关的成本和复杂性。可与冷却pE-300^超、pe - 340^fura和pE-800系列，该功能由大多数科学相机(如Andor的Zyla系列)上可用的TTL输出信号驱动，并通过led以用户选择的顺序循环每个TTL高信号。这种简单的方法提供微秒切换精确同步到相机曝光。
• 改进的对比:励磁滤光片不能阻挡所有不必要的光。与传统灯具等“白光”光源不同，离散的LED波长通常可以独立控制，与荧光团的激发光谱匹配，并增加图像对比度。这些波长范围从340-770纳米，取决于每个单独的照明系统。

图3:使用LED照明系统和平克尔滤波器设置的荧光显微镜捕捉快速事件。可控LED照明系统，如8通道冷却pE-800系列，可实现高对比度多通道成像。单个LED通道开关和内联单带激励滤波器允许Pinkel滤波器配置(单带激励滤波器与多带二向色镜和发射滤波器)，以取代滤波器轮的成本和延迟。

总之，除了提高数据质量，升级到LED照明系统可以节省3万英镑的成本。¹这在很大程度上是由于它们的寿命更长，能源效率更高。结合这种能源效率和没有有毒汞，LED照明系统也是一个流行的升级实验室寻求变得更加环保可持续发展。

毫无疑问，LED照明系统是透射或荧光照明的最佳升级之一，但有两个重要因素需要考虑:滤光片和兼容性。许多用于荧光显微镜的光学滤光片都针对汞和金属卤化物进行了优化，led优化的滤光片组可能是最大化信噪比所必需的。过滤器建议可在制造商网站(例如，很酷的，浓度)．在做出购买决定之前，确保您的显微镜与所选的LED照明系统兼容是很重要的，我们建议检查制造商网站，如CoolLED适配器搜索工具．

了解更多LED照明系统

激光照明怎么样?

虽然LED照明是具有成本效益的宽视场荧光的选择，成像系统，如共聚焦系统可能具有基于激光的照明。激光照明比其他光源具有更高的功率密度，使其特别适合于光漂白、烧蚀和超分辨率成像实验。当然，激光并不全是关于它们的高功率潜力，并且可以在较低的活细胞成像照明强度下使用。

激光光源应由训练有素的维修技术人员检查。随着时间的推移，系统中激光线的输出功率会下降，和/或光纤电缆的末端会退化，从而减少样品上的激发光量。这些可以被替换以恢复性能，或者您可以考虑新的激光器线，提供不同的波长和改进的功率输出，例如面向近红外区域。和或提供集成激光发动机在宽VIS-NIR范围内提供多达8条激光线。

增加同步多通道成像

单台相机同时多通道成像

同时多通道成像已经变得越来越普遍——从观察细胞中更多的标记成分到发现一个过程中几种特定蛋白质的相互作用，或者只是为了加快成像速度。

随着现代高分辨率相机与大传感器尺寸，它可以使用图像分割为了在传感器上分割图像通道，它可以作为多摄像头成像设置的替代方案。这种方法也比为每个额外的频道添加额外的摄像机成本低得多。你可以选择将图像分成2个、3个甚至4个通道。

• OptoSplit二世:通过在传感器上分割2个图像通道，提供2通道同时成像。适合安铎相机型号如Zyla、Sona、iXon 888系列。
• OptoSplit三世:通过在传感器上垂直分割3个图像通道，提供3通道同时成像。适合安铎相机型号如Zyla、Sona、iXon 888系列。
• 4通道成像，其他分路器选项可用于更大格式的传感器，包括大型32毫米Sona模型(4路分路器的一个例子是Multi-split来自凯恩研究公司(Cairn Research)。

图4:Optosplit在相机传感器上划分了多达3个成像通道。这为多通道成像提供了一种经济有效的途径。

在这样的应用程序bob综合app官网登录中，您需要选择合适的过滤器立方体或使用过滤器轮来分割感兴趣的图像通道。或者，这就是我们建议使用多通道LED照明系统与Sedat滤波器组的最佳效果:单带激发滤波器安置在光源中(如图3所示的Pinkel配置)，而单带发射滤波器和二向色滤波器安置在Optosplit中。这种设置结合了最新的相机、光学滤光片和照明技术，以消除与运动部件相关的延迟，同时还克服了与多波段滤光片相关的漏电风险。通过这种方式，您可以在几乎任何基本的宽视场荧光显微镜上实现高速、高对比度成像。

重要的是，你还需要有多通道成像和分析的软件。micromanager和image J的组合使用是一种免费的选择，然而，有一些商业软件包考虑到了易用性和简单性，以促进用户体验并加快数据捕获。

需要注意的是，在处理较弱的标签时，在这些类型的设置中，可能需要在sCMOS上使用较大格式的EMCCD相机(如iXon 888型号)，以确保传感器捕获足够的光子以形成高质量的图像。

多摄像头同步多通道成像

同时进行的另一种选择多通道成像是使用分光器将显微镜的一个端口的图像分割到两个或多个相机上。这种方法的主要好处是，它将为每个图像通道提供每个相机的最大视野。您还可以选择更合适的摄像机对特定通道进行成像，例如:sCMOS摄像机对较亮的信号进行成像，EMCCD摄像机对最弱的信号进行成像。

• TuCam-这是一个双摄像头分配器解决方案。它兼容安多相机，包括Zyla和Sona sCMOS系列和iXon EMCCD系列。其他多摄像头分配器现在可以在一个成像系统中使用3或4个摄像头。

图5:TuCam提供了双摄像头成像解决方案，每个通道都指向一个单独的摄像头。这样可以从每个摄像头获得完整的可用视野。

重新设定目标

如果你的显微镜仍然有原来的物镜，那就值得考虑做一些改变。显微镜制造商已经推出了更新的物镜范围，或扩大其范围，以适应成像需求的变化。最新的物镜可以通过更好的光学校正和/或场平整度来提高图像清晰度。您的实验需求可能已经改变，需要不同的物镜放大倍数更适合您当前或未来的工作。一种新的物镜也可能在蓝光- uv或近红外区域有更好的响应，以帮助最大限度地利用光谱的主要可见波段之外的标签。

添加自动化

自动化工作台对于手动工作台的显微镜来说是一个非常有用的升级。带有工作台控制器的电动工作台可以允许x和y(取决于显微镜也可以通过z)。您可以向您的显微镜供应商检查您的显微镜的可能性，以及其他3^{理查德·道金斯}派对供应商专门从制造商的舞台，如ASI而且前科学．

这不仅是一个实用的、值得拥有的升级，使显微镜上的工作不那么疲劳，当与合适的软件结合时，它可以打开成像的可能性。使用自动化分期可以实现大组织切片或更大的模式生物(如斑马鱼)的多场成像，极大地帮助了发育生物学研究。

让你的显微镜具有超分辨率

超分辨率——能够看到隐藏在经典衍射极限以下的信息，通常仅限于专用的高端成像系统。例如SIM, STORM或STED。这些系统都能够将分辨率提高到不同的水平，但仅限于这些昂贵的系统。SRRF-Stream +提供了一个很好的途径来解锁超分辨率从你的普通显微镜，让你观察到更多的内部结构和细胞的工作方式。SRRF- stream +是一种基于相机的超分辨率技术，由SRRF的原始NanoJ版本发展而来。基于srrf的超分辨率比这些其他方法提供了许多好处-不仅仅是你可以从传统显微镜获得的好处。它与正常的荧光团兼容，并在低照明强度下工作。这使得它适用于许多活细胞研究，并灵活地用于许多不同的应用。bob综合app官网登录SRRF-Stream+优化了GPU处理，使采集和处理步骤同时完成。这意味着实时活细胞的超分辨率是可能的。它可使用iXon EMCCD和Sona背光sCMOS相机。

图6:宽视场图像(左)隐藏了衍射极限以下的信息。结构细节可以通过应用SRRF-Stream+(右)在同一图像中显示。图片由Matt Caporizzo提供。

了解更多SRRF-Stream．

用光刺激来启发你的研究

光遗传学领域已经产生了一系列利用光精确调节基因、蛋白质、细胞和生理反应的工具和技术。诸如生物活性分子的释放、光激活和抑制以及光开关等技术的应用越来越广泛。控制照明强度和传递也是光漂白和荧光恢复以及消融和DNA损伤的关键。

除了不断扩大的“光活性”标签和帮助可视化的其他标签之外，基于光刺激技术的一个重要部分是照明设备精确控制所涉及的照明。许多研究者采用了两种有效的策略。它们使用一种可以控制的激光扫描样品并瞄准特定的兴趣点，然后通过基于数字微镜的设备(DMD)投射照明。微反射镜可以通过控制来创建复杂形状的照明区域，多个区域或具有精确定时的模式。

有灵活的多区域照明用马赛克Mosaic是一种基于数字微镜的光刺激应用设备。bob综合app官网登录它可以用于小区域到大面积的组织。同时照明是可能的整个图像区域或特定区域。马赛克可以集成到许多主要的显微镜，并与不同的光源兼容。这使得它非常灵活地应用于光刺激的光遗传学应用，以及动态细胞过程，如运输和信号传递。bob综合app官网登录

进行消融和漂白MicroPointMicroPoint是一种脉冲激光系统，能够在宽波长范围内消融、漂白和解冻。有可能实现控制照明能量的精确传递，使其适用于从低照明水平的光学激活抑制通过靶向高能量传递的细胞和DNA修复研究。像马赛克一样，它可以通过使用外射照明适配器集成到许多主要的显微镜中。

图7:马赛克可以对样品的照明进行精细控制，在许多光刺激实验中具有惊人的灵活性，从光激活、释放到多区域照明。

用图像分析软件深入研究你的数据

对于许多人来说，从显微镜中获得的图像不仅仅是为了获得一张好的图像来添加到你的生化或分子研究中。图像数据的用途远不止这些。我们可以通过细胞发育和疾病状态获得关于不同细胞过程、细胞结构和细胞无数其他相互作用的信息。因此，图像分析软件已成为越来越多的研究人员在帮助解决细胞生物学的许多问题。

软件包，例如伊万里瓷器提供强大的工具来理解这些问题，否则回答这些问题是非常缓慢的，如果不是几乎不可能的话。先进的渲染功能和使用反褶积可以帮助可视化并使图像数据在视觉上具有冲击力。然而，真正的科学影响和回答重要问题的能力是由软件的分析功能提供的。有用的功能包括量化细胞的大小和数量，测量成分之间的距离，跟踪蛋白质，研究细胞谱系和细胞命运。统计检验可用于比较数据集并发现存在的关系以及不同处理的效果。图像可视化和分析软件的功能不断扩展，以满足前沿研究的需求，以及更多的常规研究。基于机器学习的对象分类是最近添加的Imaris的一个例子，它可以更快地分析大型数据集。

图8:Imaris提供了图像可视化和分析工具，可以添加关于过程的有用信息，如果不是不可能的话，这些信息很难确定。

您可以使用免费的ImarisViewer自行测试Imaris，或者访问免费试用．

你把显微镜带得够远了吗?

如果你觉得你已经把你的显微镜带到了它能走的最远的地方，并且正在考虑一个新的系统-请参考我们的文章，解释了这个主题的考虑从成像技术到其他影响显微镜系统成本和性能的因素．

图9:最新的显微镜系统，如Andor台式共焦和蜻蜓系统，具有惊人的成像性能，宽视场，共焦和超分辨率功能，功能齐全的软件，使先进的成像快速和简单。图片由Julien Rességuier在NorMIC(奥斯陆大学)获得。