突触的高通量定量分析

为了更好地理解神经回路的功能，卡耐基梅隆大学的Alison L. Barth和他的同事将Imaris图像分析软件与他们开发的用于标记神经元突触后位置的基因编码试剂结合起来。

“我们想要了解在学习或患病期间神经元输入的组织是如何变化的，”Barth说。“对突触如何在大量神经元中分布进行定量分析的能力，可以为了解神经元在重要过程中如何重组它们的网络提供重要的见解。”

可再生的分析

跟踪神经元网络的变化需要以一种高度可复制的方式研究它们的连接。“这需要非常具体的标准来识别接触者，”Barth解释说。“这可以用Imaris软件完成，因为它允许特定的参数设置，以一致地检测不同动物的不同细胞的突触。”

研究人员还需要追踪并绘制三维神经元，然后为其指定特定的突触点。“这不是一个微不足道的过程，尤其是在三维空间中工作时，”巴斯说。“它需要强大的软件，比如Imaris，不仅能检测特定的特征，还能自动检测。”

该研究的首席研究员Dika Kuljis使用他们的新试剂和Imaris分析流程，检查了神经元间抑制性突触的分布。在大脑中有各种各样的分子定义的抑制性gaba能神经元。然而，研究人员不仅想要识别一个抑制性突触，他们还想知道该突触的突触前输入来自哪里。

荧光斑点检测方法。A，导入Imaris的图像文件。比例尺= 40微米。B，原始突触荧光信号。C，突触荧光信号的增益调整图，以显示昏暗的YFP信号。D，突触荧光白掩膜区分信号与背景。E，微点生成参数:0.5微米估计直径，大于三个体素大小(灰色像素)。F，所有荧光点的3D效果图(黄色)。G，从细胞表面0.5微米范围内的点状点(边缘到边缘;蓝色)。 H, Isolated cell-associated puncta (blue). I, J, Cytoplamic puncta (≤0.5 micron from cell surface; yellow). Scale bar = 5 microns. K, L, Isolated cell-surface puncta. M, Raw synaptic fluorescence used for Imaris spot detection. N, Local fluorescence intensity maxima identified using automatic detection parameters (yellow spots). O, 3D rendering of puncta centers (from L) as spots. P, Q, Alignment of puncta 3D renderings and spots. Scale bar = 1 micron. R, Alignment of spots and signal enhanced fluorescence. S, T, Alignment of spots and raw fluorescence. Scale bar = 5 microns. U, Workflow summary. Courtesy of Alison L. Barth, Carnegie Mellon University.

研究人员使用Imaris对神经表面进行高通量突触定量，然后将点分配给单个神经元进行定量分析。重要的是，他们能够设定一个特定的距离，以排除任何离神经元过程太远的东西。他们使用Imaris灯丝追踪模块创建了一个结合了表面和灯丝对象的3D细胞表面渲染。在Imaris中，使用表面物体质心将点状物体转换为“斑点”。

通过这种方法，研究人员能够检查数百个细胞，并看到抑制在不同细胞中分布的惊人多样性。分析显示，小清蛋白输入是躯体和树突的主要抑制源。据Barth说，这些细胞特别集中在初生根尖树突，这种分布以前从未被观察到。研究人员还使用Imaris制作了他们研究的细胞的非常引人注目的电影。

扩大分析

在完成这项工作后，研究人员使用了Imaris生成的一些定量信息，参加了卡内基梅隆大学(Carnegie Mellon University)的一场基于神经的黑客马拉松。因为Imaris提供了它检测到的突触的大小、形状和强度的信息，研究人员想知道这些信息是否可以让他们根据突触后斑点的荧光特性来定义突触输入。

“因为每个细胞都有这么多的点，我们无法手工进行这种类型的分析，”巴斯解释说。“在黑客马拉松期间，计算机科学家们对数据进行了分析，看看一些输入的形态与其他输入的形态有什么不同。”

在黑客马拉松中，研究人员统计了超过15万个突触，比任何其他在脑组织中进行的研究都多。数据分析显示，不同类型的输入可以根据它们的外观来区分。

影片显示了幼鼠躯体感觉皮层的第5层锥体神经元，充满了带有FAPpost标记的突触的dTomato。丘脑后内侧核的丘脑轴突用CFP标记。丘脑皮质突触的数字识别和渲染，以显示输入的分布横跨树突的锥体神经元。图片由卡耐基梅隆大学博士后Ajit Ray博士收集。

研究论文:Kuljis DA, Park E, Telmer CA, Lee J, Ackerman DS, Bruchez MP, Barth AL.细胞类型特异性连接组学荧光定量突触分析。eNeuro。2019年10月31日,6 (5):eneuro.0193 - 19.2019。doi: 10.1523 / eneuro.0193 - 19.2019。PMID: 31548370;PMCID: PMC6873163。