使用阈值3D相关显微镜

细胞生物学

法国Illkirch的DeGénétiqueet de BiologieMoléculaire和Cellulaire的研究人员开发了一种新方法，将活细胞成像与Cryofix样品上的电子显微镜（EM）相关联。根据研究团队成员之一Yannick Schwab的说法，该小组的目标是开发一种将活细胞中的光显微镜数据与相同对象的超微结构分析相关联的方法。

图：用GFP标记的BIN1转染的COS-1细胞通过共聚焦显微镜成像，通过高压冻结固定，处理60 nm厚的串行切片，并用抗GFP抗体和金颗粒标记。（a）荧光B1N1小管的代表性图像（z投影3个共聚焦切片），从/到核周区域辐射。（b）一个串行薄部分，显示了同一单元的传输 - EM图像。（c）在更高的放大倍率下，在各种核周结构（以黄色突出显示）上可见免疫染色。线粒体，高尔基体配合物和内体囊泡等未染色的细胞器以白色显示。（d）渲染整个串行部分允许将免疫元标记投影到代表性传输 - EM图片上，显示与记录在活细胞上的密集核周核GFP信号的良好相关性。（E和F）抗GFP免疫染色在核周区域的体积中的分布。（G – J）在Imaris中处理了完整的Z堆栈记录，以重建GFP荧光的3D模型（绿色）。由EM（黄色）分析的区域与D-F中的金标记有良好的相关性。（K-M）对其他Z平面的相关分析显示GFP-BIN1在质膜内陷处的定位。 Image reprinted from PLoS One.

为了实现这一目标，研究人员预先展示了有关ACLAR盘的参考网格，然后将其细胞培养。这些圆盘与冷冻固定和树脂嵌入兼容。此外，在整个制备和EM成像过程中，网格上的坐标都是保守的。使用这种方法的优点是它与各种EM技术，动态现象的高分辨率实时记录以及快速的高压冻结兼容。

在实验的初始阶段，该组使用共聚焦或落叶显微镜获得了活细胞成像数据。此后，将细胞对扫描EM进行化学固定或电子断层扫描（或串行免疫-EM）的高压冷冻。最后，从两种显微镜模式中获取的数据进行了安排，以在Imaris 3D/4D图像分析软件中进行分析和关联。

使用特定的3D强度阈值函数（Imaris软件独有的），研究人员能够根据其强度曲线在数据中选择特定对象。一旦确定了数据集中的所有对象，Schwab的组就会过滤所有较小的，不需要的对象，以仅隔离感兴趣的结构。结合使用，在Imaris中的特定阈值和3D滤波应用可以精确确定在用GFP标记的BIN1转染的细胞核周区域中形成的特定膜bob综合app官网登录小管的形状和位置。

在实验的下一阶段中，从Imaris中的分析中提取的数据用于选择一组薄层以在EM级别进行研究。使用这些部分，研究人员试图阐明免疫EM相关性。从最终分析中，施瓦布（Schwab）的小组确定了几个串行EM截面的抗GFP免疫质量分布与Imaris突出显示的荧光模式相匹配（见图）

Schwab说：“我们设法获得了动态事件的超微结构快照，或者通过共聚焦显微镜以及串行或电子断层扫描研究选定的亚细胞隔室的3-D组织。”

研究论文：Spiegelhalter C，Tosch V，Hentsch D，Koch M，Kessler P等。2010从动态活细胞成像到3D超微结构：高压冻结和相关光电子显微镜的新型集成方法。PLOS ONE 5（2）：E9014。doi：10.1371/journal.pone.0009014。