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什么是膨胀显微术?
如何从扩展样本中获得最多的信息?
传统光学显微镜受到光的衍射的限制,因此,距离小于200nm的特征无法被分辨。在一段重要的时间里,显微镜技术的发展集中在改进成像技术,以允许单个分子被分解。超分辨率显微镜技术是21世纪初发展起来的圣世纪,允许以超过200纳米障碍的分辨率成像(Schermelleh, Heintzmann等人2010,Schermelleh, Ferrand等人2019)。然而,超分辨率技术存在视场有限、成像深度有限、与多色实验不兼容、采集时间慢、对能量照明强度要求高等局限性。为了克服这些障碍,一些富有创造力的研究小组走上了不同的方向,探索如何才能实现标准化和直接的纳米级成像。扩张显微镜(ExM)是一种成像协议,它允许传统光学显微镜看到以前无法区分的次衍射限制(< 200nm)或密集填充的细节。2015年,麻省理工学院的爱德华·博伊登(Edward Boyden)团队报告了这种新型放大方式的发展。在试图克服在大脑中大规模神经回路中绘制分子图的困难时,博伊登的研究小组开发了一种放大样本本身的方法,而不是放大样本发出的信号。(Chen, Tillberg et al. 2015)。
表1-术语表。
术语表: | |
AcX | 丙烯酰- x, SE, 6 -(丙烯酰氨基hexanoïc)酯琥珀酰亚基(与蛋白质胺反应并在聚丙烯酰胺基质中共聚的交联剂) |
DiExM | 差示膨胀显微镜 |
DMAA | N,N二甲基丙烯酰胺酸-(非离子丙烯酸单体,可制成可膨胀的聚合物颗粒) |
ExFish | 扩增显微镜荧光原位杂交 |
ExM | 扩张显微镜 |
《外交政策》 | 荧光蛋白 |
遗传算法 | 戊醛(交联固定剂,穿透膜比PFA慢) |
HCR | 杂交链式反应 |
iExM | 迭代膨胀显微术 |
如果 | immunofluorophore |
马国民健康保险制度 | 甲基丙烯酸n -羟基琥珀酰亚胺酯(与蛋白质胺反应的交联剂,可在聚丙烯酰胺基质中共聚) |
地图 | 蛋白质组的最大分析 |
MBAA或BA | N N亚甲基二(丙烯酰胺)/(双丙烯酰胺)交联剂,与丙烯酰胺聚合并在聚丙烯酰胺凝胶中产生交联) |
PFA | 多聚甲醛(交联固定剂,保存蛋白质的二级/三级结构) |
ProExM | 蛋白质保留膨胀显微镜 |
SDS | 十二烷基硫酸钠(阴离子表面活性剂,用于变性和解离蛋白质) |
SRRF | 超分辨率径向波动 |
图1所示。HeLa细胞未扩张的微管(右)和4.5倍线性扩张的微管(左)共聚焦图像。成像是在一个安多旋盘共聚焦显微镜(蜻蜓)40×数值孔径(NA) 1.15水浸物镜。(一)HeLa细胞与免疫染色微管的共聚焦图像,在细胞底部的单个xy平面成像。左上角的插图放大了右中间的小方框。(B)约4.5×线性扩张的HeLa细胞的共聚焦图像,细胞底部的单个xy平面上有免疫染色的微管。左上角的插图放大了左下角的小方框。(B)中的比例尺表示扩张后的比例尺。一个展开的细胞只有一小部分能填满整个视野。各自的嵌入显示了各自的小框的全视野的缩放。(Zhang, C.,等,神经科学的当前协议, 2020)。
ExM是一种具有成本效益的样品制备方法,它包括在生物样品中合成一个紧密互联的可膨胀聚合物网络。在聚合物基质内的组织被扩展和标记。一旦浸入水中,膨胀就会使细胞结构各向同性地分开,从而在每个生物分子之间产生巨大的间隙。标本是各向同性放大,因此,一个有效的更高分辨率是可以实现的标准显微镜。在纯水中有4倍的线性膨胀,这意味着64倍的体积膨胀。使用安多旋盘共聚焦(蜻蜓)在图1所示的一个扩展的微管海拉细胞样本上显示了如何使用扩展显微镜协议,研究人员可以在他们的样本中看到以前未见过的细节。然而,在制备扩展样品时必须小心;膨胀显微镜协议的成功实施依赖于:
- 嵌入安全:聚合物需要使用非侵入性方法插入细胞。小心地将小单体插入细胞和组织中。这些单体是水凝胶的组成部分,水凝胶会膨胀。诀窍是一旦它们进入保存的细胞和组织中,就会触发单体聚合。
- 在不破坏结构的情况下扩张:关键是在扩大样本的同时保持细胞结构的完整性。为了确保膨胀不会扭曲样品,试样用加热/洗涤剂或酶消化处理,以机械均质试样,确保组织保持完整。
表2-膨胀显微镜方案的比较。请参阅上面的缩略语
协议名称 | 行政主任(博伊登实验室) | ExM(沃恩实验室) | ProExM (Boyden实验室) | 地图主任(钟实验室) | ExFiSH (Boyden实验室) |
水凝胶 | 丙烯酰胺+丙烯酸钠++ MBAA | 丙烯酰胺+丙烯酸钠+++ | 丙烯酰胺+丙烯酸钠+++ | 丙烯酰胺+++丙烯酸钠+ BA | 丙烯酰胺丙烯酸钠MBAA |
连接代理 | acrydite | MA-NHS GA | acryloyle-X (AcX) | 多聚甲醛丙烯酰胺 | LabelX (AcX + Label-IT胺) |
干扰剂 | 蛋白酶K | 蛋白酶K | 蛋白酶K | SDS | 蛋白酶K |
破坏类型 | 消化 | 消化 | 消化或轻微破坏 | 变性解离 | 消化 |
膨胀系数(线性) | 4.5 | 4.0 - -4.2 | 4 | 4 | 3.3 |
决议 | 70海里 | 65海里 | 70海里 | 60海里 | / |
FP保存 | 没有 | 是的 | 是(50%强度) | 没有 | 没有 |
如果染色 | 没有 | 是的 | 是的 | 是的 | 没有 |
样本 | 细胞,脑组织 | 细胞,脑组织 | 细胞,大脑,胰腺,肺,脾脏组织 | 细胞,大脑,脊髓,肺,心脏,肝脏,肾脏,肠道组织 | 细胞,脑组织 |
目标 | 蛋白质 | 蛋白质和DNA | 蛋白质 | 蛋白质和糖类 | RNA和DNA |
专业的评论 | 首次报道方法 | 常规荧光团细胞器水平 | 常规荧光团扩展后标记 | 扩张后标记全器官水平多重染色 | 三维成像扩展后FISH复用和HCR扩增 |
反对的评论 | 复杂的协议,没有标准的荧光团 | 膨胀前标记只有荧光损失 | 不完全均质荧光损失 | 不兼容与/ FPs准备丢失后3天 | / |
参考 | 陈等,2015年科学 | Chozonski等,2016自然方法 | Tillberg等人,2016年自然生物技术 | Ku等人,2016年自然生物 | Chen等,2016自然方法 |
变体 | iExM | x10 | x10;DiExM | uExM |
图2-预膨胀显微术原理。1)固定细胞2)对样品进行免疫染色标记,生物分子以共价锚定在凝胶上3)在凝胶化过程中,样品浸泡在单体溶液中,形成化学网络。4)均质过程中,通过酶解切切标本结构,确保组织完整。5)浸水后发生自发膨胀。在纯水中有4倍的线性膨胀(64体积膨胀)。
膨胀显微镜主要有两种方法:
- 染色生物分子,然后扩张组织(图2)
- 展开组织的生物分子,然后染色(图3)
图2和图3所示的图形表示细胞和组织扩展到4倍的协议。光的衍射极限为200纳米,这为光学显微镜所能分辨的分离物设定了界限。由于实现的线性扩展是4倍,使用这些协议,分离到50纳米的生物分子将在光学显微镜下可见。
图3-扩张后显微术原理1)细胞固定2)内源蛋白共价锚定到凝胶3)高聚丙烯酰胺浓度水凝胶包埋4)非交联蛋白变性和解离5)水浸泡膨胀6)膨胀后免疫染色可能在多轮。
膨胀显微镜的基本步骤
通过扩展,荧光信号也向各向同性扩展。结果,获得了有效的更高分辨率。膨胀显微镜协议的关键步骤是:
(参见图2和图3):
- 标签:用荧光团标记生物分子(在展开后标记方法中,这一步是在展开后的最后执行)。
- 锚定:生物分子和/或标签共价配备分子手柄。这些交联剂将允许聚合物基质对生物分子施加力。
- 凝胶为了避免破坏细胞,聚合物链被分解成它的组成部分(它的组成部分)。试样浸泡在单体溶液(丙烯酸钠)和高渗透性水凝胶(聚丙烯酸钠)中。一旦进入细胞,化学反应就会被触发,单体将结合形成所需聚合物的网络。
- 均质化:目的是避免试样变形,保证试样组织完好。通过酶解或加热和洗涤剂处理(变性/解离),样品被化学破坏。均质化处理的选择取决于样品的性质和要显示的分子。
- 扩张:试样浸入水中,水通过渗透力扩散到聚电解质水凝胶中。水会促进聚合物的膨胀。这种膨胀以各向同性的方式拉开了锚定的生物分子,并在每个生物分子之间产生了巨大的间隙。扩展标本的空间组织被保留,允许用标准荧光显微镜进行纳米级成像。
图4。扩张的有丝分裂细胞图像。微管蛋白(绿色)和DNA(蓝色)染色的分裂细胞的最大投影图像。使用后扩展协议标记单元格,并使用图像和或蜻蜓.样本由Joshua C Vaughan(华盛顿大学)提供。
最流行的扩展显微镜技术
自发展以来,几种不同的膨胀显微镜协议已经发表。目前,有各种变化和改进,涵盖了广泛的应用。bob综合app官网登录下面我们给出了一个表,总结了膨胀显微镜的主要协议。
总之,两种主要的扩展显微镜策略共存:前和后扩展标记策略(图2和图3),不同的协议适用于特定的细胞结构。当开始使用扩展显微镜成像时,必须小心选择正确的方案以可视化所需的亚细胞结构。它可能需要优化一个协议,以更好地适应实验条件;研究人员不应忘记设计适当的实验控制,以证明所分析结构的各向同性膨胀。
了解更多关于安多的产品解决方案的膨胀显微镜在我们的解决方案说明-蜻蜓是理想的扩展显微镜多模态成像平台.
参考书目:
- Chang J.-B。,et al. (2017). "迭代膨胀显微术."自然方法14(6): 593 - 599。
- Chen, F.,等人(2015)。扩张显微镜。"科学347(6221): 543 - 548。
- Chen, F.,等人(2016)。RNA的纳米级成像与膨胀显微镜。"自然方法13(8): 679 - 684
- Chozinski, t.j.,等人(2016)。”用常规抗体和荧光蛋白进行扩增镜检。"自然方法13(6): 485 - 488
- Gambarotto, D.等人(2019)。”利用扩展显微镜(U-ExM)成像细胞超微结构。"自然方法16(1): 71 - 74
- Ku T, Swaney J, Park JY,等(2016)大小可调组织中三维蛋白质定位的多路可扩展超分辨率成像。”生物科技Nat》.34(9): 973 - 981。doi: 10.1038 / nbt.3641
- Schermelleh, L.等人(2019)。”超分辨率显微技术揭开了神秘面纱。"自然细胞生物学21(1): 72 - 84。
- Schermelleh, L.等人(2010)。”超分辨率荧光显微术指南。"细胞生物学杂志190(2): 165 - 175。Pernal, s.p., et al.(2019)。”差示膨胀显微镜。"bioRxiv: 699579。
- Truckenbrodt, S.等人(2018)。”X10扩展显微镜可在传统显微镜上实现25nm分辨率。"EMBO报告19(9): e45836。
- Truckenbrodt, S.等人(2019)。”X10膨胀显微镜优化的实用指南。"自然的协议14(3): 832 - 863。
- Tillberg PW, Chen F, Piatkevich KD,等(2016)使用标准荧光蛋白和抗体标记的细胞和组织的蛋白质保留扩张显微镜”。生物科技Nat》.34(9): 987 - 992。
- Wassie, a.t.,等人(2019)。”膨胀显微镜:原理和在生物学研究中的应用。"自然方法16(1): 33-41
- Zhang, C., Kang, J. S.,浅野,S. M.,高,R., & Boyden, E. S. (2020) "初学者扩展显微镜:在扩展培养的海拉细胞中可见微管。”神经科学的当前协议,