研究人员使用图像分析更好地理解中心体成熟

用双胸苷阻滞同步HeLa细胞，并在抗中心蛋白(PCNT)免疫染色和PCNT smFISH前用DMSO载体(Control)、emetine、尖刺木酯碱或嘌呤霉素处理。代表共聚焦图像和量化的PCNT mRNA分布显示为每个条件。研究人员通过测量3D呈现的PCNT smFISH信号与最近中心体中心之间的距离，量化了PCNT mRNA在细胞中的分布。mRNA的分数作为距离最近中心体的函数，然后绘制为三个生物重复的平均值(实线)±95% CI(阴影)。注意，在尖杉酯碱或嘌呤霉素处理时，PCNT mRNA远离中心体，但在依咪汀处理时，PCNT mRNA保持在中心体附近，与对照相似。由加州大学戴维斯分校Li-En Jao提供。

由加州大学戴维斯分校的Li-En Jao领导的研究人员正在研究细胞如何在分裂前通过中心体成熟的过程迅速扩大中心体。当这个过程不能正常工作时，就会导致基因组不稳定和癌症中出现的不受控制的细胞分裂。使用伊万里瓷器软件和Andor蜻蜓他们在共聚焦显微镜系统中对细胞分裂过程中中心体如何组织微管有了新的发现。

中心体是微米级的无膜自组装细胞器。在细胞分裂之前，中心体“成熟”，因此它们的微管组织活动达到支持纺锤体微管组织所必需的最大程度。

在这项新研究中，研究人员重点研究了中心蛋白，它通过帮助招募其他蛋白质来启动中心体成熟。他们希望更多地了解细胞是如何在几分钟内产生大量这种大蛋白质并将其输送到中心体的。

探测微弱信号

为了更多地了解细胞中中心蛋白是如何以及在哪里产生的，研究人员结合了单分子RNA原位杂交(smFISH)和抗体染色来检测中心蛋白RNA和新合成的中心蛋白。RNA和新合成的蛋白质的共定位揭示了被翻译的确切RNA分子。

研究人员使用Andor蜻蜓系统对培养的人类细胞中的中心蛋白RNA和蛋白质进行了成像，这是一种旋转圆盘共聚焦显微镜，它包含了带有高灵敏度相机的微透镜共聚焦扫描仪。“蜻蜓系统提供了高灵敏度和共聚焦来检测微弱的smFISH信号，”Jao说。“它还使我们能够以高灵敏度和分辨率对中心蛋白mRNA和蛋白质进行成像。”

接下来，研究人员使用Imaris在单细胞水平上量化了中心蛋白周围RNA分子与中心体之间的分布。他们首先量化细胞内的3-D RNA分布，使用Imaris将蛋白质信号转换为表面，将mRNA信号转换为每个共聚焦z-stack反卷积图像中不同大小的点。然后，他们通过将蛋白中心蛋白信号的表面放置在原始图像上，并使用Imaris中的统计函数来获得拟合体积内原始图像的强度和，从而量化中心体上的中心蛋白强度。

中心蛋白是一次性制造和运输的

总的来说，图像分析显示，在有丝分裂过程中，中心蛋白被共翻译招募到中心体。这意味着细胞通过使用RNA分子作为模板来构建蛋白质和核糖体，以正确的顺序组装积木，从而同时构建和运输周围中心蛋白。

研究人员计划通过使用蜻蜓系统和Imaris来继续这一研究方向，以找出细胞如何在中心体成熟期间协调中心蛋白到中心体的共翻译靶向以及招募其他中心体蛋白。

研究人员使用smFISH和双免疫荧光(IF)来区分新合成的和全长的PCNT蛋白(a)。(b)前中期HeLa细胞接受PCNT smFISH和抗PCNT免疫染色，以对抗PCNT蛋白的N-和c端。假定的活性翻译位点被PCNT n项IF和PCNT smFISH标记，但没有被PCNT c项IF标记(上面板)。嘌呤霉素处理后，PCNT n项IF信号不再与PCNT smFISH信号共定位，表明RNA上的PCNT n项IF信号代表了新生的PCNT多肽。橙色框表示用橙色虚线框标记的区域对比度更高。(c-d)使用Imaris将PCNT蛋白和PCNT mRNA信号分别从共聚焦z-stack图像中呈现为“表面”和“点”的示例。(e)对距离中心体中心1 - 3µm半径的PCNT smFISH信号进行量化，以确定有无短嘌呤霉素处理的抗PCNT n项IF信号的存在。由加州大学戴维斯分校Li-En Jao提供。

研究论文:Sepulveda G, Antkowiak M, Brust-Mascher I, Mahe K, Ou T, Castro NM, Christensen LN，张L, Jiang X, Yoon D, Huang B，饶乐。2018.共翻译蛋白靶向在脊椎动物中心体成熟过程中促进PCNT的中心体募集。Elife。pii: e34959。doi: 10.7554 / eLife.34959。