生物EDS的提示和技巧
生物能量色散x射线光谱分析(EDS)是一个不断发展的领域，但对生物学家来说，这是一个挑战。当我开始使用这个技巧的时候。我的背景是生物电子显微镜，在那里EDS是非常小众的，但从那时起，EDS在生物样品中的应用已经呈指数级扩展。bob综合app官网登录无窗探测器技术的发展显著提高了对生物样品典型轻元素的灵敏度，并结合扫描电子显微镜(SEM)在低加速电压下操作的能力，为生物EDS带来了令人兴奋的机会。这里有一些建议和技巧。
1.平面和超薄截面
具有明显3D结构的样品吸收了在远离探测器的一侧产生的x射线，探测器位于样品室的一侧，导致x射线图和元素识别中的人工制品产生阴影效应。用于EDS的最佳样品类型具有相对平坦的表面。一些样品，如叶子，具有天然的扁平结构，可以直接分析。其他样品需要修剪以达到平面。细胞和内部组织结构可以通过将它们嵌入树脂中进行分析，然后修整树脂块或切割部分，这些部分可以放在网格上或扫描电镜存根上。我更喜欢对切片进行分析，因为我发现它们是最稳定的样品类型，并且它们与透射电子显微镜(TEM)和扫描电镜(SEM)兼容。水合冷冻样品也可以使用冷冻超微切片或冷冻刨技术制备。
2.为您的研究问题优化样本准备
用EDS获得的信号受样品制备的影响。在固定和包埋过程中添加对比剂会影响样品中元素的定位和检测到x射线的范围。未染色和冷冻样品将提供更好的原生元素定位分析，而染色样品可能提供样品的结构和功能信息。您的分析对哪些元素感兴趣?看看这些元素的x射线能量。其中一种污渍(例如锇)是否具有与您正在研究的元素相似的x射线能量?如果是，你们能从标本制备规程中去除它或使用另一种染色方法吗?
涂覆样品对于生物样品的SEM-EDS分析非常重要，因为它为样品提供了导电性，减少了样品的电荷量(扭曲光束和电子信号的负电荷积聚)。树脂嵌入部分可以直接安装在存根上，在使用低加速电压时不需要涂层。可选择的基材可以在切片放置之前涂上碳。应该对树脂嵌入的组织块或干燥样品进行涂层，最好涂上5-20nm的碳(取决于样品)。使树脂块尽可能小是很重要的。有利于环氧树脂或碳胶带可以用来连接你的块到标本存根。在样品或树脂块的边缘涂上银漆也有助于导电。碳涂层吸收了一些能量较低的x射线，如氮发射的x射线。如果这些元素对您的分析至关重要，则使用另一种类型的涂层或替代的样品制备方法，如切片。
未染色细胞的TEM-EDS图像拟南芥。细胞来源于叶维管束。样品固定于醛中，脱水后嵌入LR白中。未进行包埋前或包埋后染色。元素图显示了细胞的超微结构信息，不需要染色，细胞核(N)和液泡(V)定义清晰。该图像是使用Ultim Max TLE探测器和AZtecTEM软件TEM工作在200kV的STEM模式下，光斑大小为2。样品朝向EDS检测器倾斜20°。元素地图以1024像素的分辨率收集，驻留时间为50µs，处理时间为5。
3.显微镜条件
显微镜条件在任何形式的电子显微镜中都起着重要的作用，一个好的起点是使用与样品类型兼容的条件。透射电子显微镜(TEM)-EDS系统需要具备扫描TEM (STEM)成像的能力。将样品向EDS检测器倾斜20度会使你从样品中收集到的x射线数量产生显著差异。样品上光束的剂量会影响你获得的信号，但更高的剂量也会损坏或破坏你的样品。这对低温电子显微镜来说尤其重要。
生物样品的扫描电子显微镜(SEM)通常使用相对较低的加速电压(5kV或更低)来减少样品损伤并提高图像分辨率。这是因为加速电压(kV)直接影响试样和电子束相互作用的体积。kV越高，电子就越深入样本，产生电子和x射线信号的体积就越大。kV的相应降低将减少交互体积并提高信号的空间分辨率。为了在所有加速电压下最大化SEM- EDS分析的分辨率和信噪比，您应该使用EDS供应商推荐的工作距离(这是您的样品和物镜极片之间的距离)。例如，Ultim Extreme的推荐显微镜工作距离通常为10mm。
x射线的产生取决于样品中的元素以及kV。一个好的经验法则是使用加速电压，它至少是你试图检测的x射线发射能量的2.5倍。这通常只是SEM-EDS的问题，因为TEM加速电压通常要高得多。增加束流电流或使用更大的聚光镜孔径将有助于增加在低千伏下产生的x射线数量，记为x射线计数。所要求的加速电压范围将影响检测器的选择。生物样品的最佳分析通常使用较低的加速电压来实现，在这种应用中，Ultim Extreme灵敏度的提高和它的高实心角(这是视场，增加EDS探测器的尺寸和形状，减小探测器与样品的距离，提高其实心角和可以从样品中检测到的x射线量)是一个巨大的优势。对于7kV以上的工作，需要Ultim Max范围的探测器。
冬青叶表面显示硫(粉红色)和硅(蓝色)污染。为了避免将污染物从表面冲洗掉，样品没有固定。样品已被轻轻干燥，并安装在一个铝存根。样品的边缘涂上银漆，样品表面涂上20nm的碳。样品成像使用Ultim极端在扫描电镜的高分辨率模式和加速电压5kV, 1nA电流检测器。使用1024个像素的分辨率和50µs的像素停留时间和4个处理时间收集地图需要10分钟。
4.慢慢来
通过长时间收集x射线，可以收集x射线计数率非常低的数据。使用诸如像素停留时间、图像和地图分辨率以及处理时间等参数来优化成像或分析条件。您可能需要大量快速图像来快速构建样本地图，并让其运行10-60分钟(或更长时间)，或者您可以专注于获得具有较长停留时间的区域的2或3次扫描。你需要收集整个地区的x光地图吗?也许你只是需要一个更大范围内更小的区域。我发现，在可能的情况下，生物样本在更高的放大倍率下成像是有益的，因为我可以得到我正在分析的元素的更好的地图，或者使用更低的放大倍率，从我视野内的小区域收集数据。
在进行任何长时间分析时，尽可能减少样本漂移是很重要的。AZtec有一个功能，将允许您纠正一些样本漂移称为自动锁定。我发现这对生物样本来说是一个非常宝贵的特征，即使是那些在电子束下看起来稳定的样本。
我希望这篇文章能给人们提供一些指导。你发现了什么技巧吗?这里有什么您想了解的吗?请在下方评论与我们的团队取得联系，并浏览我们的应用笔记更多不同类型的样品使用EDS的例子。
